Мегаобучалка Главная | О нас | Обратная связь

Методы изучения ДНК в генетических исследованиях





Как было показано выше, нарушения первичных продуктов генов выявляются с помощью биохимических методов. Локализация соответствующих повреждений в самом наследственном материале может быть выявлена методами молекулярной генетики.

Разработка метода обратной транскрипции ДНК на молекулах мРНК определенных белков с последующим размножением этих ДНК привела к появлению ДНК-зондов для различных мутаций нуклеотидных последовательностей человека. Использование таких ДНК-зондов для гибридизации с ДНК клеток пациента дает возможность выявлять у него соответствующие изменения в наследственном материале, т.е. диагностировать определенные виды генных мутаций (генодиагностика).

Важными достижениями молекулярной генетики последних десятилетий явились работы по секвенированию — определению нуклеотидной последовательности ДНК.

Это стало возможным благодаря открытию в 60-х гг. XX в. ферментов — рестриктаз, выделенных из бактериальных клеток, которые разрезают молекулу ДНК на фрагменты в строго определенных местах. В естественных условиях рестрикгазы защищают клетку от проникновения в ее генетический аппарат и размножения в нем чужеродной ДНК. Применение этих ферментов в эксперименте дает возможность получать короткие фрагменты ДНК, в которых относительно легко можно определить последовательность нуклеотидов.

В настоящее время полностью установлена последовательность нуклеотидов многих генов человеческого генома, в том числе генов α- и (β-глобиновых цепей гемоглобина, некоторых полипептидных гормонов (инсулина, гормона роста, хорионического соматотропина, пролактина). Интенсивно изучаются нуклеотидные последовательности генов актинов, тубулинов, интерферонов. Этими исследованиями выявлена высокая степень генетического полиморфизма у человека, который часто не проявляется фенотипически.

Методы молекулярной генетики и генной инженерии позволяют не только диагностировать целый ряд генных мутаций и устанавливать нуклеотидную последовательность отдельных генов человека, но и размножать (клонировать) их и получать в большом количестве белки — продукты соответствующих генов.



Клонирование отдельных фрагментов ДНК осуществляется путем включения их в бактериальные плазмиды, которые, автономно размножаясь в клетке, обеспечивают получение в большом количестве копий соответствующих фрагментов ДНК человека. Последующая экспрессия рекомбинантных ДНК в бактериях позволяет получить белковый продукт соответствующего клонированного человеческого гена.

Таким образом, с помощью методов генной инженерии стало возможно получать на основе человеческих генов некоторые первичные генные продукты (инсулин). Это определяет перспективы терапии наследственных болезней, обусловленных связанным с генными мутациями дефицитом нормальных продуктов генов.

Дальнейшее совершенствование методов молекулярной генетики обеспечит возможность полного определения нуклеотидных последовательностей не только структурных, но и регуляторных локусов генома человека, а разработка методов включения в человеческий геном нормальных нуклеотидных последовательностей в перспективе может стать основой генотерапии.

 

ГЕННАЯ ИНЖЕНЕРИЯ

Ге́нная инжене́рия — совокупность приёмов, методов и технологий получения рекомбинантных РНК и ДНК, выделения генов из организма (клеток), осуществления манипуляций с генами и введения их в другие организмы. Генная инженерия служит для получения желаемых качеств изменяемого организма.

Генная инженерия не является наукой в широком смысле, но является инструментом биотехнологии, используя исследования таких биологических наук, как молекулярная биология, цитология, генетика, микробиология. Самым ярким событием, привлёкшим наибольшее внимание и очень важным по своим последствиям, была серия открытий, результатом которых явилось создание методов управления наследственностью живых организмов, причём управления путём проникновения в «святая святых» живой клетки — в её генетический аппарат.

Учёные, биохимики и молекулярные биологи научились модифицировать гены или создавать совершенно новые, комбинируя гены различных организмов. Они научились также синтезировать гены, причём точно по заданным схемам. Они научились вводить такие искусственные гены в живые организмы и заставили их там работать. Это было начало генетической инженерии. Задумаемся над следующим обстоятельством.

Основа микробиологической, биосинтетической промышленности — бактериальная клетка. Необходимые для промышленного производства клетки подбираются по определённым признакам, самый главный из которых — способность производить, синтезировать, при этом в максимально возможных количествах, определённое соединение — аминокислоту или антибиотик, стероидный гормон или органическую кислоту.

Иногда надо иметь микроорганизм, способный, например, использовать в качестве «пищи» нефть или сточные воды и перерабатывать их в биомассу или даже вполне пригодный для кормовых добавок белок. Иногда нужны организмы, способные развиваться при повышенных температурах или в присутствии веществ, безусловно смертельных для других видов микроорганизмов. Задача получения таких промышленных штаммов очень важна, для их видоизменения и отбора разработаны многочисленные приёмы активного воздействия на клетку — от обработки сильно действующими ядами до радиоактивного облучения.

Цель этих приёмов одна — добиться изменения наследственного, генетического аппарата клетки. Их результат — получение многочисленных микробов-мутантов, из сотен и тысяч которых учёные потом стараются отобрать наиболее подходящие для той или иной цели. Создание приёмов химического или радиационного мутагенеза было выдающимся достижением биологии.

Но их возможности ограничиваются природой самих микроорганизмов. Они не способны синтезировать ряд ценных веществ, которые накапливаются в растениях, прежде всего в лекарственных и эфирномасличных. Не могут синтезировать вещества, очень важные для жизнедеятельности животных и человека, ряд ферментов, пептидные гормоны, иммунные белки, интерфероны да и многие более просто устроенные соединения, которые синтезируются в организмах животных и человека. Разумеется, возможности микроорганизмов далеко не исчерпаны. Из всего изобилия микроорганизмов использована наукой, и особенно промышленностью, лишь ничтожная доля.

Для целей селекции микроорганизмов большой интерес представляют, например, бактерии анаэробы, способные жить в отсутствие кислорода, фототроты, использующие энергию света подобно растениям, хемоавтотрофы, термофильные бактерии, способные жить при температуре, как оказалось недавно, около 250 °С (олово плавиться при температуре 232 °С), и др.

И всё же ограниченность «природного материала» очевидна. Обойти ограничения пытались и пытаются с помощью культур клеток и тканей растений. Это очень важный и перспективный путь. За последние несколько десятилетий учёные создали методы, благодаря которым отдельные клетки тканей растения или животного можно заставить расти и размножаться отдельно от организма, как клетки бактерий.

Это было важное достижение — полученные культуры клеток используют для экспериментов и для промышленного получения некоторых веществ, которые с помощью бактериальных культур получить невозможно. Но здесь тоже есть свои трудности, например неспособность животных клеток в культуре делиться бесконечное число раз, как это происходит с бактериями.

Кроме того, получить и выращивать культуры клеток труднее, чем бактериальные культуры. (Есть и свои преимущества, но о них пойдёт речь дальше, так как они оказались кстати уже в новых условиях, когда биотехнология сформировалась и начала своё самостоятельное развитие.) И учёные стремились научиться изменять гены, вводить нужные гены в живой организм, так сказать, «редактировать» книгу природы.

Коло десяти лет назад было сделано несколько фундаментальных открытий. Был впёрвые получен изолированный, «химически чистый» ген. Затем были открыты ферменты — рестриктазы и лигазы. С помощью рестриктаз ген можно разрезать на кусочки — нуклеотиды. С помощью лигаз такие кусочки можно «склеивать», соединять в иной комбинации, конструируя новый ген.

Почти одновременно успешно завершились многолетние попытки «прочитать» ту биологическую информацию, которая «записана» в генах. Эта работа была проделана английским учёным Ф. Сегнером и американским учёным У. Гилбертом. За неё учёные были удостоены Нобелевской премии по химии (1980). Для Сенгера эта премия была уже второй; он стал первым химиком, получившим награду дважды; первый раз он был награждён за расшифровку строения белка.

Как известно, в генах содержится информация-инструкция для синтеза в организме молекул белков-ферментов. Значит, для того чтобы заставить клетку синтезировать новые, необычные для неё вещества, надо чтобы в ней синтезировались соответствующие наборы ферментов. А для этого необходимо или целенаправленно изменить находящиеся в ней гены, или ввести в неё новые гены, чуждые ей. Изменения генов в живых клетках — это мутации. Они происходят под действием, например, мутагенов — химических ядов или излучений. Но такие изменения нельзя контроли-ровать или направлять. Поэтому учёные сосредоточили усилия на попытках разработать методы введения в клетку новых, совершенно определённых генов, нужных человеку. Для этого, во-первых, необходимо было научиться получать желаемые гены.

Первоначально такие гены пытались просто выделить из подходящих клеток, но потом оказалось, что, зная их строение, проще получать их синтетически, с помощью отработанных биохимических методик. Во-вторых, необходимо было разработать методику введения гена в клетку. Причём нужно было научиться не просто вводить ген в цитоплазму, а встраивать его в собственную молекулу ДНК клетки, так, чтобы новая информация могла быть «прочитана» биосинтетическим аппаратом клетки, вырабатывающим белки, а также воспроизводящим гены при делении клетки. Осуществление этих двух этапов — получение гена и введение его в клетку — и составляет, собственно, основу той отрасли биотехнологии, которая получила название индустрии ДНК.

Разработать методику, как первого, так и второго этапов было невероятно трудно. Однако за очень короткий срок биохимики научились синтезировать гены. Сейчас процесс синтеза генов разработан очень хорошо и даже автоматизирован. Существуют специальные аппараты, снабжённые ЭВМ, в памяти которых заложены программы синтеза различных структурных генов. За день такой аппарат синтезирует необходимые отрезки ДНК длиной в 100—120 азотистых оснований (содержащих информацию для синтеза участка полипептидной цепи белка в 30-40 аминокислотных остатков).

Основные трудности были связаны с введением готового гена в наследственный аппа-рат клетки. Собственно, именно из-за этих трудностей ещё 15-20 лет назад затеи с модифи-кацией генетического аппарата считали безнадёжным и даже фантастическим делом.

Необходимо было создать общий и воспроизводимый метод включения кусочков гена в полный генетический аппарат клетки. При этом новый фрагмент гена должен был быть помещён очень точно с соблюдением ряда условий, для того чтобы клетка действительно начала синтезировать новые ферменты. Надо было также обойти сопротивляемость клетки-хозяина: как правило, все изменения генетического аппарата воспринимаются клеткой как «ошибки информации» и исправляются специальными механизмами.

Однако в природе наблюдаются случаи, когда чужеродная ДНК (вируса или бактериофага) включается в генетический аппарат клетки и с помощью её обменных механизмов начинает синтезировать «свой» белок. Учёные исследовали особенности внедрения чужеродной ДНК и использовали как принцип введения генетического материала в клетку.

 





Читайте также:


Рекомендуемые страницы:


Читайте также:
Личность ребенка как объект и субъект в образовательной технологии: В настоящее время в России идет становление новой системы образования, ориентированного на вхождение...
Как вы ведете себя при стрессе?: Вы можете самостоятельно управлять стрессом! Каждый из нас имеет право и возможность уменьшить его воздействие на нас...

©2015-2020 megaobuchalka.ru Все материалы представленные на сайте исключительно с целью ознакомления читателями и не преследуют коммерческих целей или нарушение авторских прав. (1312)

Почему 1285321 студент выбрали МегаОбучалку...

Система поиска информации

Мобильная версия сайта

Удобная навигация

Нет шокирующей рекламы



(0.006 сек.)