Методы микробиологической диагностики лептоспироза

Таксономия боррелий, лептоспир и трепонем, и названия заболеваний, вызываемых ими.

Семейство:Spirochaetaceae

Род: Borrelia

Вид: B. recurrentis – возбудитель эпидемического возвратного тифа.

Род: Treponema

Вид: T. pallidum - возбудитель сифилиса

Род: Leptospira

Вид: L. Icterohaemorrhagiae – возбудитель лептоспироза

Микроскопическая диагностика сифилиса.

Темнопольная микроскопия: перед исследованием берут тканевую жидкость со дна язвы или пунктат лимфатического узла. Готовят препарат раздавленной капли: на середину предметного стекла наносят каплю исследуемого материала, каплю накрывают покровным стеклом так, чтобы не было пузырьков воздуха. Положительный результат: при микроскопии обнаруживаются трепонемы с равномерными 8-12 крупными завитками. Для них характерны плавные вращательно-поступательные, маятникообразные и сгибательные движения.
При окраске по Романовскому-Гимзе: возбудитель сифилиса окрашивается в бледно-розовый цвет, другие трепонемы – в красновато-фиолетовый.

Реакции, используемые в серодиагностике сифилиса. Общая характеристика каждой из них.

РСК (реакция Вассермана): Компоненты: 1 система – сыворотка больного, диагностикум, комплемент, ИХН; 2 система – гемолитическая сыворотка и взвесь эритроцитов барана. Готовят 1 систему, инкубируют 37С 1 ч. Добавляют вторую, инкубируют 37С 1 ч. Положительный результат – отсутствие гемолиза.

РПГА: Компоненты: ИХН, сыворотка больного, эритроцитарный диагностикум. Готовят разведения сыворотки, добавляют диагностикум, в термостат 24 ч 37С. Пол. результат: зонтик.

ИФА: Компоненты: сыворотка больного, диагностикум, конъюгат, хромогенный субстрат. Связывают диагностикум с пластиком лунки планшета, вносят разведенную сыворотку, конъюгат и субстрат. Пол. результат: изменение окраски субстрата.

Непрямая РИФ: на предметное стекло наносят АГ – бледные трепонемы (штамм Никольса). Мазки высушивают на воздухе и фиксируют в ацетоне 5 минут. Сыворотку больного истощают взвесью непатогенных трепонем штамма Рейтера или разводят 1:200, затем наносят на приготовленные препараты. Выдерживают во влажной камере при 35С 30 мин (1 фаза). Мазки промывают 10 минут в ИХН и высушивают. Далее наносят на препарат каплю флюоресцирующей сыворотки против глобулина человека и инкубируют во влажно камере при комнатной температуре 30 мин (2 фаза). Мазки промывают ИХН, высушивают. Просматривают в люминесцентном микроскопе. Положительная реакция: зеленое свечение.

Реакция флоккуляции на стекле: плазму крови или непрогретую сыворотку смешивают с неспецифическим липидным антигеном в течение нескольких минут на предметном стекле. Положительный результат: под малым увеличением видны укрупненные частицы антигена (флоккулят).

Серодиагностика сифилиса с использованием РПГА.

Компоненты: ИХН, сыворотка больного, эритроцитарный диагностикум. Готовят разведения сыворотки, добавляют диагностикум, в термостат 24 ч 37С. Пол. результат: зонтик.

5. Серодиагностика сифилиса с использованием ИФА.

Компоненты: сыворотка больного, диагностикум, конъюгат, хромогенный субстрат. Связывают диагностикум с пластиком лунки планшета, вносят разведенную сыворотку, конъюгат и субстрат. Пол. результат: изменение окраски субстрата.

6. Серодиагностика сифилиса с использованием РСК.

Реакция Вассермана: можно использовать сыворотку крови больного и спинномозговую жидкость (на стадии нейросифилиса). В качестве диагностикума – трепонемный или кардиолипиновый антиген. Компоненты: 1 система – сыворотка больного, диагностикум, комплемент, ИХН; 2 система – гемолитическая сыворотка и взвесь эритроцитов барана. Готовят 1 систему, инкубируют 37С 1 ч. Добавляют вторую, инкубируют 37С 1 ч. Положительный результат – отсутствие гемолиза.

Методы микробиологической диагностики лептоспироза.

Бактериоскопический метод: готовят препарат раздавленной капли, изучают его в темнопольном микроскопе: подвижные тонкие нити с изгибами на концах (вторичные завитки) – в виде скобы или буквы S.

Бактериологический метод: материал – кровь, моча, спинномозговая жидкость. Материал засевают (3-5 пробирок) в водно-сывороточную среду, среду Флетчера, Картофа. Инкубируют до 30 суток при 28-30С в атмосфере СО₂. Для выявления роста лептоспир через 10 дней после посева из пробирки берут материал, готовят препарат раздавленной кали и изучают в темнопольном микроскопе. Из пробирки, где обнаружен рост лептоспир, пересевают в 3 пробирки со свежей питательной средой, инкубируют 7-10 дней, температура та же. Для дифференциации проводят бикарбонатный тест, определяют гемолитическую активность, фосфолипазную активность. Идентифицируют по антигенной структуре с помощью агглютинирующих сывороток.

Биологическое исследование: морским свинкам вводят внутрибрюшинно 1 г исследуемого материала и наблюдают в течение месяца, отмечая температуру и вес тела, появление желтухи и кровоизлияний, а также гибель животного.

Серологическое исследование: АТ в сыворотке появляются со 2 недели. Используют реакции микроагглютинации и лизиса лептоспир. Сыворотку больного разводят двукратно от 1:100 до 1:1600. В ряд пробирок вносят 0,2 мл разведенной сыворотки и такое же количество живой культуры штаммов лептоспир. Инкубируют 1 час при 37С. Из содержимого каждой пробирки готовят препарат раздавленной капли и микроскопируют. АТ в сыворотке первых разведений обусловливают лизис – растворение или зернистое набухание лептоспир. В последующих разведениях – агглютинация – агломераты в виде паучков. Диагностическое значение имеет положительная реакция в разведении 1:400 и выше.