Морфологические методы выявления Helicobacter pylori (HP)

Морфологическиеметоды выявления Helicobacter pylori достаточно надежны и их даже называют «золотым стандартом». В настоящее время существуют как гистологические методы диагностики геликобактериоза (поиск микроба в гистологи­ческом биоптате слизистой оболочки желудка), так и цитологические методы (по­иск микроба в раздавленном биоптате). Обнаружить Helicobacter pylori можно на обычных, окрашенных гематоксилином и эозином препаратах, если они достаточно тонкие и хорошо окрашены. Однако целесообразно проводить элективные методы окраски. Лучшими из них являются: по Граму, по Романовскому-Гимзе, по Вартину-Старри (кстати, именно при этой окраске биоптатов их и обнаружили в 1983 г.), акри­диновым оранжевым, карболовым фуксином, толуидиновым синим. В зависимости от того, какая методика применяется в лаборатории лечебного учреждения, такую и целесообразно использовать, поскольку чувствительность их близка, хотя считаются более чувствительными окраски по Гимзе, Граму и акридиновым оранжевым (85% и 79% соответственно). При выполнении микробиологических и морфологических методов выявления Helicobacter pylori необходимо учитывать, что микроб обычно колонизирует неравномерно, и в биоптат могут не попасть колонии Helicobacter pylori. Для повышения точности исследования необходимо брать несколько биоптатов поднимаясь от пилорического отдела желудка к кардии (3-5 кусочков). Описанные методики не только достаточно дороги, требуют высокой диагностической техники, но и результат исследования получается через несколько дней (7-10). В настоящее время имеются методики, позволяющие достаточно легко проводить цитологическое выявление Helicobacter pylori в мазке желудочной слизи.

Helicobacter pylori в гистологических препаратах (цитологических) определяют при увеличении х 630, а лучше - х 1000. Оценивают степень обсемененности при увеличении х 630: 1) слабая степень - до 20 микробных тел в поле зрения, 2) средняя степень до 50 микробных тел в поле зрения; 3) высокая степень - более 500 микро­бных тел в поле зрения. Если исследования проводятся с использованием светового микроскопа при увеличении х 1000, то оценку обсемененности слизистой проводят по следующим критериям: «О» степень - нет микробных тел, «I» - 1-9 микробных тел в поле зрения, «2» - 10-29 микробных тел в поле зрения, «З» - 30-99 - микро­бных тел в поле зрения, «4» - 100 и более микробных тел в поле зрения (рис. 21).

Рисунок 21. Helicobacter pylori в биоптате слизистой оболочки желудка. Окраска по Гимзе, х 1000

Био­химические тесты выявления Helicobacter pylori (HP)

Для ускорения диагностики предлагаютсяинвазивные методики, дающие ре­зультат непосредственно во время исследования. Из них можно назвать такие био­химические тесты, как промышленно выпускаемые системы CLO- тест, Кампи-тест, Хелпил-тест и др.

Они основаны на способности Helicobacter pylori разрушать мочевину с образованием аммиака и углекислого газа. При этом в случае внесения биоптата в рас­твор мочевины с индикатором типа фенолрот меняется окраска раствора. Несмотря на высокую чувствительность, эти тесты могут давать отрицательные резуль­таты в связи с отсутствием Helicobacter pylori в биоптате. В последнее время для повышения чувствительности исследования предложены иммунологические тесты, выполняемые непосредственно на слизистой желудка о время эндоскопии. Во время эндоскопии на слизистую наносят специальные антисыворотки против Helicobacter pylori или раствор мочевины с индикатором и по изменению окраски сли­зистой судят о наличии микроорганизма.

Значительно более простым и эффективным способом диагностики хеликобактериоза считается использованиенеинвазивных биохимических и иммунологических тестов.

Биохимические методы диагностики хеликобактериоза в настоящее время распространяются повсеместно. Они основаны на способности Helicobacter pylori рас­щеплять мочевину. Для исследования используется мочевина, меченная изотопами углерода С¹³ и С¹⁴. Это так называемые уреазные дыхательные тесты.

При их проведении пациент после пробного завтрака получает 20,0 воды, содер­жащей мочевину, меченную изотопом углерода. Спустя 10, 20, 30, 40, 60, 80, 100, 120 минут пациент выдыхает воздух в специальный сосуд, содержащий вещества, связывающие выдыхаемый углекислый газ, или на специальную пластину. В зависи­мости от количества выделяемого меченного углекислого газа судят о наличии или отсутствии HP на слизистой желудка. Диагностическая чувствительность и специ­фичность данных тестов превышает 95%. Однако работа с мочевиной, меченной С¹³ и С¹⁴. требует очень дорогого оборудования (до 250000 долларов США), а изотоп С¹⁴ обла­дает радиоактивностью. Близкие методики предполагают использование мочевины, содержащей изотоп азота N¹⁵. По выделяемому с мочой меченному азоту в течение 2 часов получают результат исследования. Чувствительность этого метода составляет 96% при 100% специфичности.

В настоящее время в широкую практику входит уреазный дыхательный тест с использованием нерадиоактивной мочевины. В выдыхаемом пациентом воздухе автоматически определяется уровень аммиака, а не радиоактивного азота. Газоанализа­торная аппаратура для этого исследования выпускается в нашей стране и отличается низкой ценой при высокой чувствительности и портативности.

Используемая в настоящее время диагностическая система Pronto Dry позволяет выявлять инфицированность Helicobacter pylori непосредственно при выполнении эндоскопического исследования в течение 5 минут. Для этого достаточно нанести на слизистую желудка специальный реактив и по изменению окраски судить о наличии или отсутствии Helicobacter pylori.

Биохимические методики диагностики хеликобактериоза в настоящее время считаются наиболее удобными для скрининг-диагностики и оценки эффективности эрадикации Helicobacter pylori.

ПЦР-диагностика

ПЦР (полимеразная цепная реакция) представляет собой многократно повторяющиеся циклы синтеза (амплификации) специфической области ДНК-мишени в присутствии термостабильной ДНК-полимеразы, дезоксинуклеотидтрифосфатов, соответствующего солевого буфера и олигонуклеотидных затравок-праймеров, которые определяют границы амплифицируемого участка.

Каждый цикл состоит из трех стадий с различными температурными режимами. На первой стадии при +94°C происходит разделение цепей ДНК, затем при +56°С - +60°C - присоединение (отжиг) праймеров к комплементарным последовательностям на ДНК-мишени, и при температуре +72°C протекает синтез новых цепей ДНК путем достраивания цепей праймеров в направлении 5` -3`.

В каждом цикле происходит удвоение числа копий амплифицируемого участка, что позволяет за 25-40 циклов наработать фрагмент ДНК, ограниченный парой выбранных праймеров, в количестве, достаточном для ее детекции с помощью электрофореза или альтернативными ему технологиями.

В мире накоплен обширный клинико-лабораторный опыт по использованию метода ПЦР (полимеразная цепная реакция) для выявления ДНК Н.pylori в биопсийном материале. Высокие показатели чувствительности и специфичности ПЦР делают этот метод во многом революционным в лабораторной диагностике.