Определение белка с помощью диагностических полосок

Для определения белка в моче на полоске в качестве инди-катора чаще всего используется краситель бромфеноловый синий в цитратном буфере. О содержании белка в моче судят по интен-сивности сине-зеленой окраски, развивающейся после контакта реакционной зоны с мочой. Результат оценивается визуально или с помощью анализаторов мочи.

Несмотря на популярность и очевидные преимущества методов сухой химии (простота, скорость выполнения анализа) данные методы определения белка не лишены серьезных недостатков:

· большая чувствительность индикатора бромфенолового синего к альбумину по сравнению с другими белками т.е. к выявлению селективной гломерулярной протеинурии, когда практически весь белок мочи представлен альбумином;

· при прогрессировании процесса и переходе селективной протеинурии в неселективную (появление в моче глобулинов) результаты оказываются заниженными по сравнению с истинными значениями, т.е. при тубулярной протеинурии результаты белка занижен;

· отсутствие возможности оценки протеинурией в динамике;

· не является надежным индикатором низких уровней протеин-урии (тест-полоски не обладают способностью улавливать белок в концентрации ниже, чем 0,15 г/л);

· отрицательные результаты определения белка на полосках не исключают присутствия в моче глобулинов, гемоглобина, уромукоида, белка Бенс-Джонса и других парапротеинов;

· ложноположительные результаты при высоком содержании гликопротеидов, мочевины, которые часто оседают на индикаторной зоне, маскируя истинные результаты;

· субъективизм оценки при плохом освещении и нарушении цветоощущения может быть причиной неточного результата.

В связи с этим, использование диагностических полосок следует ограничить скринирующими процедурами, а результаты, полученные с их помощью, следует рассматривать лишь как ориентировочные.

Количественные методы

Количественное определение белка в моче связано с определенными трудностями, обусловленными следующим факторами:

1) низким содержанием белка в моче здорового человека, часто находящимся на пороге чувствительности большинства известных методов;

2) присутствием в моче множества соединений, способных изменять ход химических реакций;

3) значительными колебаниями содержания и состава белков мочи при различных заболеваниях, затрудняющими выбор адекватного калибровочного материала.

С точки зрения специалиста-аналитика, работающего в лаборатории, метод, предназначенный для количественного определения белка в моче, должен отвечать следующим требованиям:

- обладать линейной зависимостью между поглощением обра-зовавшегося в ходе химической реакции комплекса и содержанием белка в пробе в широком диапазоне концентраций, что позволит избежать дополнительных операций при подготовке пробы к исследованию;

- должен быть прост, не требовать высокой квалификации исполнителя, выполняться при малом количестве операций;

- обладать высокой чувствительностью, аналитической на-дежностью при использовании небольших объемов исследуемого материала;

- быть устойчивым к воздействию различных факторов (коле-бан-иям состава образца, присутствию лекарственных препаратов и др.);

- обладать приемлемой стоимостью;

- быть легко адаптируемым к автоанализаторам;

- результат определения не должен зависеть от белкового сос-тава исследуемого образца мочи.

Ни один из известных к настоящему времени методов коли-чественного определения белка в моче не может в полной мере претендовать на роль «золотого стандарта».

Количественные методы определения белка в моче можно разделить на турбидиметрические и колориметрические.

К турбидиметрическим методам относятся:

1) определение белка с сульфосалициловой кислотой (ССК),

2) определение белка с трихлоруксусной кислотой (ТХУ),

3) определение белка с бензетоний хлоридом.

Турбидиметрические методы основаны на снижении растворимости белков мочи вследствие образования суспензии взвешенных частиц под воздействием преципитирующих агентов. О содержании белка в исследуемой пробе судят либо по интенсивности светорассеяния, определяемого числом светорассеивающих частиц (нефелометрический метод анализа), либо по ослаблению светового потока образовавшейся суспензией (турбидиметрический метод анализа).

Величина светорассеяния в преципитационных методах обна-ружения белка в моче зависит от множества факторов: скорости смешивания реактивов, температуры реакционной смеси, значения pH среды, присутствия посторонних соединений, способов фотометрии. Тщательное соблюдение условий реакции способствует образованию стабильной суспензии с постоянным размером взвешенных частиц и получению относительно воспроизводимых результатов.

Некоторые лекарственные препараты влияют на результаты турбидиметрических методов определения белка в моче, приводя, к так называемым, «ложноположительным», либо «ложноотрицательным» результатам. К ним относятся некоторые антибиотики (бензилпенициллин, клоксациллин и др.), рентгеноконтрастирующие йодсодержащие вещества, сульфаниламидные препараты.

Турбидиметрические методы плохо поддаются стандартизации, часто приводят к получению ошибочных результатов, но, несмотря на это, в настоящее время они широко используются в лабораториях из-за невысокой стоимости и доступности реактивов. Наиболее широко используется метод определения белка с сульфосалициловой кислотой.

Колориметрические методыявляются наиболее чувстви-тельными и точными, основанные на специфических цветных реак-циях белков. К ним относятся: биуретовая реакция, метод Лоури, методы, основанные на способности различных красителей образо-вывать комплексы с белками – Понсо S (Ponceau S), Кумасси брил-лиантовый синий (Coomassie Brilliant Blue), пирогаллоловый красный (Pyrogallol Red).

Биуретовый метод характеризуется высокой аналитической надежностью, позволяет определять белок в широком диапазоне концентраций, выявлять альбумины, глобулины и парапротеины со сравнимой чувствительностью, вследствие чего биуретовый метод рекомендуют для сравнения других аналитических методов обнаружения белка в моче.

Из-за большого числа операций биуретовый метод предпочтительно используют в лабораториях, обслуживающих нефрологические отделения, или в тех случаях, когда результаты определения белка другими методами оказались сомнительными, а также для определения величины суточной потери белка у нефрологических больных.

Метод Лоури, обладающий более высокой чувствитель-ностью по сравнению с биуретовым методом, сочетает биуретовую реакцию и реакцию Фолина на аминокислоты тирозин и триптофан в составе белковой молекулы. Несмотря на высокую чувствительность, данный метод не всегда обеспечивает надежные результаты содержания белка в моче. Причиной тому служит неспецифическое взаимодействие реактива Фолина с небелковыми компонентами мочи (чаще всего аминокислотами, мочевой кислотой, углеводами). Отделение этих компонентов из мочи путем диализа или осаждения белков позволяет с успехом использовать данный метод для количественного определения белка в моче. Некоторые лекарственные препараты – салицилаты, хлорпромазин, тетрациклины способны оказывать влияние на данный метод и извращать результаты исследования.

Методы, основанные на способности различных красите-лей образовывать комплексы с белками. Достаточная чувствительность, хорошая воспроизводимость и простота определения белка по связыванию красителей делают эти методы перспективными, однако высокая стоимость реактивов препятствует более широкому их использованию в лабораториях. В настоящее время все большее распространение получает метод с пирогаллоловым красным.

Учитывая, что различные методы определения протеинурии имеют разную чувствительность и специфичность к многочисленным белкам мочи, рекомендуется определять белок двумя разными методами и рассчитывать истинное значение по одной из приведенных формул:

протеинурия = 0,4799 B + 0,5230 L;
протеинурия = 1,5484 B – 0,4825 S;
протеинурия = 0,2167 S + 0,7579 L;
протеинурия = 1,0748 P – 0,0986 B;
протеинурия = 1,0104 P – 0,0289 S;
протеинурия = 0,8959 P + 0,0845 L;

где: B– результат измерения с Кумасси G-250; L - результат измерения с реактивом Лоури; P- результат измерения с молибдатом пирогаллола; S - результат измерения с сульфосалициловой кислотой.

Учитывая выраженные колебания уровня протеинурии в различное время суток, зависимость концентрации белка в моче от диуреза, различное его содержание в отдельных порциях мочи, принято оценивать выраженность протеинурии по суточной потере белка с мочой, то есть определять так называемую суточную протеинурию, выраженную в г/сут.

При невозможности сбора суточной мочи рекомендуется определять в разовой порции мочи концентрации белка и креатинина. Поскольку скорость выделения креатинина в течение дня достаточно постоянна и не зависит от изменения скорости мочеотделения, отношение концентрации белка к концентрации креатинина постоянно. Данное отношение хорошо коррелирует с суточной экскрецией белка и, следовательно, может использоваться для оценки выраженности протеинурии.

В норме отношение белок/креатинин должно быть менее 0,2. Белок и креатинин измеряют в г/л. Важным достоинством метода оценки выраженности протеинурии по соотношению белок-креатинин является полное исключение ошибок, связанных с невозможностью или неполным сбором суточной мочи.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ГЛЮКОЗЫ

Методы определения глюкозы в моче направлены как на установление наличия, так и количества сахара, соответственно все методы определения глюкозы делят на качественные (пробы Гайнеса, Ниландера, Фелинга, Бенедикта, Мора и другие) и количественные (с помощью поляриметра или путем титрования мочи).

Качественные пробы основаны на редуцирующей способности альдегидной группы глюкозы к восстановлению и изменению окраски раствора. К редукционным пробам относятся пробы Фелинга, Ниландера, Гайнеса. Проба Гайнеса основана на свойстве глюкозы восстанавливать гидрат окиси меди в щелочной среде в гидрат закиси меди (желтый цвет) или закись меди (красный цвет). Проба Ниландера основана на восстановлении глюкозой нитрата висмута в металлический висмут, давая изменение окраски раствора от коричневого до красного цвета.

Количественные методы используют свойства глюкозы вращать плоскость поляризованного луча вправо при использовании прибора поляриметра.

Колориметрический метод Альтгаузена использует сопоставление цветной реакции, получаемой при добавлении к исследуемой пробе мочи щелочи, кипячении раствора с рядом цветных стандартов, соответствующих различным концентрациям глюкозы в моче. В настоящее время широко применяются экспресс-методы обнаружения глюкозы в моче с применением готовых наборов.