РЕАКЦИЯ ПРЕЦИПИТАЦИИ (РП)

Цель занятия.

1. Усвоить суть реакции преципитации, методы ее постановки и практическое применение.

2. Освоить методы получения антигена в реакции преципитации.

3. Отработать методику постановки реакции преципитации.

Материалы и оборудование. Пробирки е РА, поставленной на предыдущем занятии. Пробирки сэкстрагированным антигеном (например, сибиреязвенный), С преципитирующей сывороткой, гомологичной антигену, с нормальной сывороткой, чистые преципитационные пробирки (Уленгута) и штативы к ним, тонкие пастеровские пипетки, резиновые груши, агар в колбах и водяная баня для расплавления агара, предметные стекла, стерильные чашки Петри, эксикаторы. Для демонстрации: готовая РП в агаровом геле, пробойник для создания углублений (луночек) в агаре. Таблицы.

Методические указания: Реакция преципитации (РП) относится к моносистемным, прямым (осадочным) реакциям. В отличие от РА в РП применяют растворимые антигены в виде прозрачных или слегка опалесцирующих растворов. Антигеном в РП служит фильтрат убитой кипячением культуры или фильтрат экстракта исследуемого материала (кожсырье, мясо, несвежий патологический материал и др.). Это качественный метод исследования. Наиболее популярна в медицинской и ветеринарной практике реакция Асколи для обнаружения антигена возбудителя сибирской язвы.

В реакции участвуют мелкодисперсные антигены (преципитиногены), которые связываются с соответствующими антителами (преципитинами). Чаще всего эту реакцию применяют для выявления антигенов по известной иммунной преципитирующей сыворотке, содержащей антитела-преципитины. При смешивании антигена (преципитиногена) и антитела (преципитина) образуются видимые агрегаты частиц (помутнение, хлопья) постепенно оседающие на дно пробирки. Образующийся осадок называется преципитатом. Антигены - преципитиногены резистентны к нагреванию (кипячению, автоклавированию) и гниению. Их получают экстрагированием из разрушенных бактерий, тканей. Существуют физические и химические методы получения антигенов для РП.

Физические методы:

а) механическое разрушение - густую массу отмытых физраствором бактериальных клеток растирают в стерильной ступке с песком или стеклянным порошком, затем наливают небольшое количество нейтрального физраствора, центрифугируют (или фильтруют) до получения прозрачной жидкости, которую используют как антиген;

б) замораживание и оттаивание (особенно повторное) густой взвеси бактерий - это приводит к разрушению клеточной стенки и выходу протоплазмы в раствор. После центрифугирования надосадочную жидкость (антиген) используют в работе;

в) метод звуковых колебаний - применяют специальные аппараты с особым зуммером. Прибор погружают внутрь жидкости с взвесью бактерий и включают - клетки разрушаются (как при действии ультразвука);

г) кипячение - наиболее распространенный метод получения преципитиногена - бактериальную взвесь (или измельченную ткань) в физиологическом растворе кипятят 1-2 ч, фильтруют через асбестовую вату. Полученный прозрачный фильтрат-антиген - обладает высокой специфичностью.

Химические методы(в случаях необходимости).

Для разрушения бактерий в условиях производства биопрепаратов, а также в научных целях используют аутолиз бактериальных клеток, их разрушение ферментами, высушиванием в ацетоне и др.

Постановка РП осуществляется в пробирках в жидкой среде или в плотной агаровой среде на предметном стекле и в чашках Петри (диффузионная преципитация). Хотя существует метод постановки РП путем смешивания антигена с сывороткой в пробирках, но распространенным в практике ветеринарных лабораторий для диагностических целей является метод Асколи (1910) - реакция кольцепреципитации (чаще применяется для диагностики сибирской язвы).

Методика постановки реакции кольцепреципитации следующая. В узкие пробирки Уленгута (диаметр 4 мм) тонкой пастеровской пипеткой разливают одинаковое количество специфической преципитирующей сыворотки (изготовляемой биофабрикой) по 0,3-0,4 мл и антигена. Технику постановки реакции осуществляют либо наслаиванием антигена на сыворотку; либо подслаиванием сыворотки под антиген (чтобы не произошло смешивания, так как сыворотка тяжелее антигена). Если в пробирки сначала разлита сыворотка, фильтрат экстракта (другой пипеткой) осторожно наслаивают по стенке пробирки, не касаясь сыворотки. Пробирку полагается держат вертикально. Если же в пробирку предварительно разлили антиген (экстракт), то другой пипеткой сыворотку подслаивают под антиген, пипетку вводят осторожно (чтобы ни одна капля не упала) до дна пробирки, также осторожно приподнимают палец правой руки, закрывавший верхнее отверстие пипетки, затем пипетку вынимают, не взбалтывая жидкости. При подслаивании или наслаивании, в случаях положительного результата, на границе двух жидкостей почти сразу или в течение 1-2 мин образуется резко отграниченное кольцо (смотреть сбоку) или диск - преципитат (рис. 57).

Специфичность реакции проверяют контролями сыворотки и антигена. Контроль сыворотки: на иммунную сыворотку в отдельных пробирках наслаивают в одну пробирку 0,1 мл физраствора, в другую - 0,1 мл стерильной среды, на которой готовился антиген, в третьей пробирке - к 0,1 мл сыворотки +0,1 мл гетерогенного антигена. Для контроля антигена в отдельные 2-3 пробирки разливают нормальную сыворотку того же вида животного (не гипериммунизированного), от которого получена преципитирующая сыворотка, сверху добавляют по 0,1 мл антигена, оставляют при комнатной температуре и учитыва­ют через 1-2 мин.

Рис. 7. Реакция кольцепреципитации в пробирках.

Реакция считается положительной:

1) если диск (кольцо) преципитата появляется вскоре после наслаивания антигена (или подслаивания сыворотки) через несколько минут (не позже 1-2);

2) если в контрольных пробирках реакция отрицательная - нет преципитата (диска-кольца).

При постановке РП соблюдают определенные условия, нарушение которых ведет к неправильным (ложным) результатам.

Реакция диффузионной преципитации (РДП).Метод простой диффузии по Удену: агар, содержащий специфическую преципитирующую сыворотку, разливают в чашки Петри. Когда он застынет, антиген наслаивают на поверхность агара. По методу Аухтерлони сыворотку вносят в специальные лунки в агаре, содержащем антиген. Более широкое распространение получил метод, двойной диффузии в агаровом геле (рис. 8). В застывшем агаре на предметном стекле и в чашках Петри делают углубление (луночки) на- некотором расстоянии одно от другого. В одну из них вносят специфическую сыворотку, в другие, расположенные вокруг первой, - разные пробы антигена (исследуемого материала). Оба компонента в луночках (сыворотка и исследуемый материал) диффундируют во встречном направлении в слое агарового геля. На месте встречи специфических антигена и антитела выпадает сероватый преципитат в виде полосок, линий. Вариантов методик постановки двойной диффузии преципитации много. В основном суть состоит в следующем: на предметное стекло, лежащее горизонтально, наливают тонким слоем 1 %-ный хорошо отмытый агар (толщина 2-3 мм). Когда агар застынет, на его поверхность наливают второй слой агара. Когда и он застынет, вырезают колодцы (луночки) верхнего слоя агара диаметром до 3 мм с помощью стандартного штампа. Расстояние между лунками около 4 мм. Тонко оттянутой на конце пипеткой Пастера (для каждой лунки отдельной) в луночки (соответственно) вносят сыворотки и антигены. Стекла помещают в эксикатор, оставляют при комнатной температуре на сутки.

Рис. 8. Реакция преципитации в агаровом геле:

из лунок а и в антиген (М) диффундирует в агар. Аналогично из лунки б диффундирует сыворотка, содержащая антитела (преципитины) по направлению к антигену. По линии контакта между ними происходит РП (широкая белая линия).

В положительных случаях образуются четкие линии преципитата на границе встречи антигена-антител (сыворотки).

Реакция диффузионной преципитации в агаровом геле на предметном стекле считается быстрой и ориентировочной. Ставят диффузионную преципитацию в агаровом геле в чашках Петри: в стерильные чашки Петри с ровным дном наливают тонким слоем 1 %-ный расплавленный агар (с мертиолатом), распределяют тонким слоем по всей поверхности дна чашки - этим создается предохранительный слой, препятствующий подтеканию компонентов реакции под слой геля, в котором происходит преципитация. Когда слой агара застынет, на его поверхности расставляют металлические (фарфоровые) цилиндрики 5-8 мм в диаметре и наливают слой агара. Когда агар застынет, цилиндрики осторожно вынимают пинцетом за верхний край, образуются лунки с ровными краями. Расстояние между лунками 15 мм. Если исследуют несколько антигенов, то одну лунку образуют в центре и в нее вносят специфическую преципитирующую сыворотку, а вокруг - лунки с разными антигенами (экстракты исследуемого материала), чашки помещают в эксикатор и термостат. Реакцию учитывают через сутки. Положительным качеством метода РП в агаровом геле является возможность ее использования для реакции с относительно мутными антигенами, а также простота техники. Недостатки этих методик - длительность реакции, несовершенство количественного анализа (особенно при исследовании токсинов) и слабая чувствительность в отношении некоторых бактерийных токсинов.

В основе реакции иммуноэлектрофореза лежит сочетание электрофореза и преципитации. Этот метод приобрел особую популярность в последние годы при исследовании антигенной структуры микроорганизмов. Антигенный комплекс помещают в лунку, которая находится в центре геля, залитого на стеклянную пластинку.

Затем через гель пропускают электрический ток. Происходит электрофорез белков, различные антигены перемещаются на неодинаковые расстояния соответственно своей электрофоретической подвижности. После окончания электрофореза в канавку, расположенную по краю пластинки (параллельно направлению движения белков), вносят специфическую иммунную сыворотку. Затем пластинку помещают во влажную камеру. В местах образования комплекса антиген - антитело появляются дугообразные линии преципитации.

Для выявления токсинов и определения активности антитоксических сывороток служат: метод Района (1922) - осадочная реакция флокуляции и метод Эрлиха - реакция нейтрализации токсина (с включением биопробы). Метод Эрлиха широко используют для установления видовой принадлежности бактерийных токсинов в исследуемом материале для определения активности антитоксаческих сывороток (и для типизации некоторых видов вирусов). Эту реакцию используют в диагностических бактериологических лабораториях для определения вида микроба (анаэроба) или типа микробного токсина (возбудители злокачественного отека, дизентерии ягнят, энтеротоксемии овец).

Методика постановки реакции нейтрализации (по Эрлиху): в пробирки с равным количеством антигена в 1 мл (например, 1000 смертельных доз токсина возбудителя столбняка) добавляют равный объем убывающего количества (убывающей концентрации) специфической гипериммунной антитоксической сыворотки. Смесь токсин - антитоксин встряхивают в пробирках и помещают в термостат при 37 °С на 1-2 ч, затем из каждой пробирки смесь вводят лабораторным животным (по два животных на каж­дую дозу антитоксина, чаще морским свинкам). Животные, получившие смесь из пробирок, где произошла нейтрализация токсина, остаются живыми (остальные гибнут). Наименьшее количество сыворотки (наибольшее ее разведение), нейтрализовавшее токсин, принимается за единицу активности антитоксической сыворотки (АЕ). Чем меньше это количество, тем активнее сыворотка.

Занятие 6.