РЕАКЦИЯ ИММУННОГО ЛИЗИСА.
Цель занятия: 1. Усвоить сущность постановки РСК, методику и назначение титрации компонентов. 2. Ознакомиться с методикой постановки РСК и с учетом результата.
Материалы и оборудование. Длинные железные штативы для пробирок, чистые сухие пробирки, градуированные пипетки, резиновые груши, физраствор NаC1, водяная баня (37-38 0С) с термометром, гемолизин в ампулах и отдельно в разведении 1 : 100, 2,5 % -ная взвесь эритроцитов барана, таз для отработанных пробирок. Для демонстрации взятия крови из сердца: морская свинка (живая), стерильный шприц с соответствующей иглой, стерильный физраствор. Таблицы (схемы) хода постановки реакции и титрации гемолизина и комплемента. Антиген, комплемент, гемолизин, разведенные в соответствующих титрах, инактивированные сыворотки (1 : 10), позитивная и нормальная сыворотки, разлитые по пробиркам (часть позитивной и нормальной сыворотки надписаны - испытуемая сыворотка, остальные подписаны - позитивная, нормальная соответственно), взвесь эритроцитов барана (1 : 40). Методические указания.Сначала студенты учитывают реакцию преципитации в агаровом геле (в чашках) с прошлого занятия. Затем после показа преподавателем взятия крови из сердца у морской свинки (для приготовления комплемента) и установочного объяснения к постановке РСК студенты по два человека приступают к работе: титруют гемолизин, определяют его фактический и рабочий титр. Антитела-лизины способны растворять микробы или другие клеточные элементы. Однако свое действие лизины могут проявлять только в присутствии комплемента. Для постановки реакций инактивированным нагреванием готовят сыворотку, затем добавляют живую микробную взвесь и комплемент. После инкубации в термостате реакцию оценивают с помощью повторных количественных высевов. В качестве контроля используют исследуемую культуру микробов, нормальную сыворотку и комплемент. Феномен Исаева-Пфейффера основан на реакции иммунного лизиса, которую ставят in vivo и употребляют обычно для лабораторной диагностики холеры. Смесь культуры микроба со специфической иммунной сывороткой вводят внутрибрюшинно морским свинкам. При соответствии выделенной культуры и иммунных антител происходит растворение микроорганизмов. Это можно установить с помощью микроскопии мазков, взятых из экссудата, или при посеве на агар (отсутствие роста). Реакцию связывания комплемента (РСК) широко используют для лабораторной диагностики венерических болезней, риккетсиозов, вирусных инфекций. Реакция протекает в две фазы. Первая фаза - взаимодействие антигена и антител при обязательном участии комплемента, Вторая фаза - выявление результатов реакции при помощи индикаторной гемолитической системы (эритроцитов барана и гемолитической сыворотки). Разрушение эритроцитов гемолитической сывороткой происходит только в случае присоединения к гемолитической системе комплемента. Если же комплемент адсорбировался ранее на комплексе антиген - антитело, то гемолиза эритроцитов не наступает. При наличии в исследуемой сыворотке антител, комплементарных антигену, образующийся комплекс антиген-антитело связывает (адсорбирует) на себе комплемент. При добавлении гемолитической системы гемолиза не происходит, так как весь комплемент израсходован на специфическую связь комплекса антиген-антитело, а эритроциты остались неизменными. При отсутствии в сыворотке антител, комплементарных антигену, специфический комплекс антиген-антитело не образуется, и комплемент остается несвязанным. Поэтому при добавлении гемолитической системы комплемент присоединяется к ней. Результатом реакции в данном случае будет гемолиз эритроцитов - в пробирках образуется так называемая «лаковая» кровь. Ввиду сложности реакции все компоненты, участвующие в ней, должны быть оттитрованы и взяты в равных объемах.
Реакция связывания комплемента (РСК)впервые описана Борде и Жангу (1901). В отличие от РА и РП при РСК соединение антигена с антителом проявляется только в присутствии третьего компонента - комплемента. Реакция образования комплекса антиген - антитело - комплемент - невидимая. Чтобы выявить указанное взаимодействие компонентов реакции, используют дополнительную индикаторную систему, которая по своей наглядности проявления косвенно отражает результат взаимодействия в первой системе. Таким образом, в РСК участвуют две системы: 1) бактериолитическая (диагностическая); 2) гемолитическая (вспомогательно-индикаторная), которая позволяет установить, произошло ли связывание комплемента в первой системе (рис. 9). Ранее в качестве антигена использовали взвесь бактерий, и в положительных случаях происходил их лизис (бактериолиз), поэтому первая система получила название бактериолитической. Следовательно, в основу РСК легли два явления - бактериолиз и гемолиз. РСК осуществляют в два этапа. Сначала готовят бактериолитическую систему - в пробирках смешивают по 0,5 мл исследуемую инактивированную сыворотку с антигеном, добавляют комплемент в строго определенном количестве (титре). Смесь антиген - антитело (сыворотка) - комплемент (бактериолитическая система) помещают в водяную баню (или термостат) при 37-38 °С на 20-40 мин. Далее приступают ко второму этапу реакции - во все пробирки добавляют компоненты второй гемолитической системы и вновь ставят в водяную баню на 15-20 мин. Затем учитывают предварительный результат (есть или нет гемолиза), оставляют при комнатной температуре до следующего дня и производят окончательный учет РСК. Отсутствие гемолиза (положительный диагностический результат) свидетельствует, что в испытуемой сыворотке имеются антитела, специфичные взятому антигену комплекс антиген - антитело в первой системе образ шалея, комплемент связался. Добавляют компонент второй системы - гемолизин и эритроциты, которые один по отношению к другому тоже являются антигеном (эритроциты) и антителом (гемолизин) и взаимодействуют в присутствии комплемента. Если же в исследуемой сыворотке нет антител, специфичных к взятому антигену, комплекс антиген - антитело не образуется и комплемент в первой бактериолитической системе не адсорбируется, остается в пробирке свободным, то при добавлении второй (гемолитической) системы комплемент взаимодействует с комплексом антиген - антитело (гемолизин - эритроциты) и происходит гемолиз (лизис эритроцитов). Диагностический результат отрицательный. Таким образом, в РСК участвуют 5 компонентов: антиген, антитело (исследуемая сыворотка), комплемент, гемолизин, взвесь эритроцитов барана, Для разведения всех компонентов используется электролитная среда - физраствор NaCl. Для постановки РСК в диагностической лаборатории необходимо следующее: пробы сывороток от животных, поступившие в лабораторию для исследования; две сыворотки заведомо позитивные (стандартные, гипериммунные, обеспечивающие положительный результат - для контроля) и две нормальные сыворотки от здоровых животных - также для контроля (все сыворотки в разведении 1 : 10 инактивируют для разрушения их собственного комплемента нагреванием в водяной бане при 56-58 °С 30 мин); антиген в разведении согласно титру (указанному биофабрикой на упаковке); комплемент (сыворотка морской свинки) в разведении соответственно установленному титру (при титрации); гемолизин в рабочем титре; взвесь эритроцитов барана в разведении 1 : 40, физиологический раствор, градуированные пипетки различной емкости, пробирки, штативы, водяная баня, резиновые груши. Ниже излагается классический метод постановки РСК, несколько упрощенный для удобства усвоения студентами и проведения в условиях учебных занятий.
Популярное: Почему двоичная система счисления так распространена?: Каждая цифра должна быть как-то представлена на физическом носителе... Генезис конфликтологии как науки в древней Греции: Для уяснения предыстории конфликтологии существенное значение имеет обращение к античной... ©2015-2020 megaobuchalka.ru Все материалы представленные на сайте исключительно с целью ознакомления читателями и не преследуют коммерческих целей или нарушение авторских прав. (1105)
|
Почему 1285321 студент выбрали МегаОбучалку... Система поиска информации Мобильная версия сайта Удобная навигация Нет шокирующей рекламы |