Обязательные подготовительные этапы работы в лаборатории.

Приготовление взвеси эритроцитов: у барана из яремной вены берут кровь стерильной иглой в стерильную колбочку (флакон) со стеклянными (фарфо ровыми) бусами или шариками и с небольшим количеством физраствора. Кровь встряхивают осторожно круговыми движениями, фибрин оседает на шариках, кровь становится дефибринироащушй. Жидкую часть сливают в центрифужные пробирки, центрифугируют, жидкость над осадком отсасывают, осадок ресуспендируют физраствором, вновь центрифугируют и надосадочную жидкость отсасывают. Такое отмывание эритроцитов повторяют несколько раз, пока жидкость над осадком эритроцитов не станет совсем бесцветной и прозрачной, затем ее удаляют, а осадок разводят физраствором 1 : 40.

Сыворотки, поступившие для исследования, и контрольные (позитивные и нормальные) разводят физраствором 1 : 5 или 1 : 10, инактивируют в водяной бане при 56-58 °С 30 мин (сыворотки ослов, мул, лошаков инактивируют при 61 °С 30 мин).

А н т и г е н для РСК готовят на биофабриках. Обычно это экстракты из разрушенных бактерий (взвеси бактерий), или инфицированной ткани, то есть растворимые антигены, не обладающие.гемолизирующим действием. На ампуле антигена биофабрика указывает его специальное предназначение - для РСК (сапной, бруцеллезный или другой). На упаковочной коробке ставят номер серии, указывают активность антигена (его титр, то есть в каком разведении его нужно использовать в работе - 1 : 100, 1 : 150 и т.п.). При отдельных заболеваниях антигеном служат другие материалы, например для диагностики плевропневмонии (микоплазмоза) крупного рогатого скота антигеном является лимфа теленка, экспериментально зараженного подкожно или интраплеврально. При длительном хранении антигенов их вновь титруют в лаборатории по специальной схеме.

Комплемент был открыт Бухнером (1889). Это составная часть свежей сыворотки крови, лимфы, тканевых жидкостей животных разных видов (и человека). Обычно в РСК используют свежую сыворотку крови морской свинки как наиболее чувствительный комплемент (активный). Комплемент -. вещество белковой природы, сложной структуры, быстро инактивируется при нагревании, длительном хранении, ультрафиолетовом облучении, сильном встряхивании, при фильтрации через керамические фильтры, от добавления каолина, кислот, щелочей, алкоголя, ацетона, хлороформа, дистиллированной воды, бактериального загрязнения и др. Комплемент можно консервировать добавлением к сыворотке морской свинки 5 г сернокислого натра, 4 г борной кислоты на 100 мл. Активность комплемента при этом сохраняется до полугода.

В настоящее время биопромышленность выпускает комплемент, консервированный высушиванием в условиях вакуума при низкой температуре (лиофилизация). Высушенный, затем запаянный в ампулах комплемент сохраняется два года. Перед каждой постановкой РСК комплемент титруют (см. занятие 18), проверяют его активность - определяют титр - оптимальное количество, необходимое для данной реакции (доза для одной пробирки).

Гемолизин готовят на биофабриках путем гипериммунизации кроликов отмытыми эритроцитами барана: кроликам внутривенно вводят 4-5 раз с 2-3-дневными интервалами 40-50 %-ную взвесь отмытых эритроцитов. Через неделю после последней инъекции у кроликов берут кровь, стерильно отсасывают сыворотку, инактивируют ее, консервируют глицерином 1 : 1 или 0,5 %-ным фенолом, титруют, разливают по ампулам. В лабораториях перед постановкой РСК гемолизин вновь титруют.

Схема титрации гемолизина. Для титрации готовят гемолизин в разведении 1 : 100 (6,2 мл гемолизина, консервированного глицерином, +9,8 мл физраствора), комплемент - 1 : 20, взвесь эритроцитов барана (1 : 40), физиологический раствор NaCI. В штатив размещают два ряда пробирок: один ряд - вспомогательный, только для приготовления нужных разведений гемолизина, второй - собственно для его титрации.

Для разведения гемолизина в первую пробирку вспомогательного ряда вносят исходное разведение 1 : 100,затем производят последовательные разведения, как показано на рисунке 60 (верхний ряд): из каждой пробирки соответствующего разведения гемолизина переносят в отдельную пробирку второго ряда по 0,5 мл (указано стрелками). Во все пробирки второго ряда добавляют по 0,5 мл комплемента, по 0,5 мл взвеси эритроцитов (в указанном разведении) и по 1 мл физраствора, чтобы в каждой пробирке объем жидкости составлял 2,5 мл (учитывая, что в главном опыте РСК участвуют пять компонентов по 0,5 мл, то есть общий объем 2,5 мл). На протяжении всей работы этот объем соблюдается. Все пробирки встряхивают и помещают их на водяную баню при 37-38 °С на 10-15 мин.

Учет результата титрации начинают с пробирок с наибольшим содержанием гемолизина (наименьшим разведением), где прежде всего должен быть гемолиз (1 : 500, 1 : 1000...). В пробирке с наименьшим количеством гемолизина (наибольшим его разведением), где произойдет полный гемолиз (лизис эритроцитов), жидкость станет красной и прозрачной, это количество принимают за предельный титр (фактический) гемолизина.

ТИТРАЦИЯ КОМПЛЕМЕНТА

Титрация комплемента в гемолитической системе. Готовят исходное разведение комплемента 1 : 20 (1 мл комплемента + 19 мл физраствора), гемолизин, разведенный соответственно рабочему титру, взвесь эритроцитов барана (1 : 40), физиологический раствор. В пробирки, поставленные в один ряд в штатив, разливают градуированной пипеткой разное количество комплемента, увеличивая дозу в каждую следующую пробирку на 0,03 мл (0,13; 0,16; 0,19; 0,22... до 0,43 мл). Затем в эти же пробирки добавляют физраствор в количестве, составляющем вместе с комплементом 0,5 мл, то есть в первую 0,37, в последующие - 0,34; 0,31; 0,28. . .0,16 мл, затем добавляют во все пробирки по 0,5 мл гемолизина, по 0,5 мл эритроцитов барана и по 1 мл физраствора (рис. 61). Все пробирки встряхивают и помещают в водяную баню на 10-15 мин (при 37-38 °С), после чего учитывают результат, определяют титр комплемента, то есть наименьшее количество его, обеспечившее полный гемолиз (например, 0,22 или 0,25). Учитывать результат начинают с пробирки с наибольшим содержанием комплемента, где прежде всего должен произойти гемолиз (справа налево).

При титрации комплемента и гемолизина (вся работа от титрации- компонентов до постановки главного опыта РСК проводится в один день) ставят контроли: каждый компонент в отдельной пробирке - гемолизин в рабочем титре 0,5 мл + 0,5 мл взвеси эритроцитов + 1,5 мл физраствора; комплемент - 1 : 20 - 0,5 мл + 0,5 мл эритроцитов + 1,5 мл физраствора. Пробирки встряхивают и ставят в водяную баню. В этих контрольных пробирках гемолиз должен отсутствовать.

Схема титрации комплемента в бактериолитической системе. Готовят: комплемент (1 : 20), взвесь эритроцитов барана (1 : 40), гемолизин в рабочем титре; две позитивные и две нормальные сыворотки; специфический антиген (в титре, указанном на этикетке). Сыворотки (1 : 10) инактивируют при 56-58 °С 30 мин. Каждую сыворотку разливают в два ряда пробирок по 0,5 мл, во все пробирки добавляют комплемент в возрастающих количествах, начиная с дозы его титра в гемолитической системе, в последующие пробирки увеличивают количество на 0,03 мл и, как это было при титрации в гемсистеме, добавлением физраствора выравнивают объем до 0,5 мл. В пробирки одного ряда каждой сыворотки (позитивных и нормальных) добавляют по 0,5 мл антигена, во второй ряд этих же сывороток добавляют по 0,5 мл физраствора. Все пробирки встряхивают и ставят в водяную баню при 37-38 °С на 30-40 мин, после чего во все пробирки вносят по 0,5 мл гемолизина и по 0,5 мл взвеси эритроцитов, встряхивают и вторично помещают в водяную баню на 10-15 мин.

Затем учитывают результат титрации, начиная просмотр с пробирок второго ряда каждой сыворотки (без антигена) и нормальных сывороток с антигеном (первый ряд). В этих пробирках следует ожидать полный гемолиз, учитывая лишь наименьшее количество комплемента, вызвавшее этот гемолиз при условии, что в первых рядах пробирок с позитивными сыворотками и антигеном с той же дозой комплемента будет полная задержка (отсутствие) гемолиза. Наименьшее количество комплемента, обеспечившее полный гемолиз в нормальной сыворотке с антигеном и без него, при полной задержке его в позитивной сыворотке с антигеном, называют титром комплемента в бактериолитической системе. В этом же титре комплемент используют для постановки РСК (с диагностической целью).