Тема «БИОПРЕПАРАТЫ В ИММУНОЛОГИИ»

Цель занятия:

1. Ознакомиться со средствами иммунопрофилактики и требованиями, предъявляемыми к ним.

2. Ознакомиться со средствами иммунодиагностики и требованиями, предъявляемыми к ним

Материалы и оборудование: Флаконы с различными вакцинами, сыворотками, плакаты, предметные стекла, наборы красок для окраски по методу Грама, микроскопы, питательные среды, бактериологические петли.

Методические указания. В общем комплексе противоэпизоотических мероприятий особое место отводят своевременной диагностике, специфической профи­лактике и терапии инфекционных болезней.

Биологической промышленностью для ветеринарной и медицинской практики выпускается большое количество различных биопрепаратов. В соответствии с целевым назначением и принципами изготовления их подразделяют на следующие группы:

1) вакцины;

2) лечебно-профилактические иммунные сыворотки и иммуноглобулины;

3) диагностические иммунные сыворотки и иммуноглобулины;

4) диагностические антигены и аллергены;

5) бактериофаги.

Биопрепараты для промышленных целей производят на специализированных предприятиях - биокомбинатах или биофабриках.

Контроль за производством биопрепаратов, разработкой стандартов и технических условий для ветеринарных целей осуществляет Всесоюзный государственный научно-контрольный институт ветеринарных препаратов (ВГНКИ), Москва.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ВАКЦИН

Для специфической профилактики инфекционных заболеваний используют вакцины, которые позволяют формировать активный иммунитет у животных до их естественного контакта с возбудителем.

Вакцины, предназначенные для профилактики одной инфекции, называются моновакцинами, против двух - дивакцинами, против трех - травакцинами, против нескольких - поливакцинами. Ассоциированными считают вакцины, содержащие смесь антигенов различных микроорганизмов и анатоксинов. Поливалентными считают вакцины, которые включают несколько разновидностей серологических типов возбудителей одной инфекции (лептоспироза, колибактериоза, сальмонеллеза, псевдомоноза норок, болезни Марека и др.).

Для иммунопрофилактики инфекционных заболеваний используют вакцины различных типов.

Живые вакцины. Представляют собой взвесь вакцинных штаммов микроорганизмов (бактерий, вирусов, риккетсий), выращенных на различных питательных средах. Обычно для вакцинации используют штаммы микроорганизмов с ослабленной вирулентностью либо лишенных вирулентных свойств, но полностью сохранивших иммуногенные свойства. Данные вакцины производят на основе апатогенных возбудителей, аттенуированных (ослабленных) в искусственных или естественных условиях. Аттенуированные штаммы вирусов и бактерий получают путем инактивации гена, ответственного за образование фактора вирулентности, или за счет мутаций в генах, неспецифически снижающих эту вирулентность.

В последние годы для получения аттенуированных штаммов некоторых вирусов используется технология рекомбинантных ДНК. Крупные ДНК-содержащие вирусы, такие, как вирус осповакцины, могут служить векторами для клонирования чужеродных генов. Такие вирусы сохраняют свою инфекционность, а зараженные ими клетки начинают секретировать белки, кодируемые трансфицированными генами.

В связи с генетически закрепленной утратой патогенных свойств и потерей способности вызывать инфекционное заболевание вакцинные штаммы сохраняют способность размножаться в месте введения, а в дальнейшем - в региональных лимфатических узлах и внутренних органах. Вакцинная инфекция продолжается несколько недель, не сопровождается ярко выраженной клинической картиной заболевания и приводит к формированию иммунитета к патогенным штаммам микроорганизмов.

Живые ослабленные вакцины получают из аттенуированных микроорганизмов. Ослабление микроорганизмов также достигается при вы­ращивании культур в неблагоприятных условиях. Многие вакцины с целью увеличения сроков сохранения выпускают в сухом виде.

Живые вакцины имеют существенные преимущества перед убитыми, в связи с тем, что они полностью сохраняют антигенный набор возбудителя и обеспечивают более длительное состояние невосприимчивости. Однако, учитывая тот факт, что действующим началом живых вакцин являются живые микроорганизмы, необходимо строго соблюдать требования, обеспечивающие сохранение жизнеспособности микроорганизмов и специфической активности вакцин.

В живых вакцинах отсутствуют консерванты, при работе с ними необходимо строго соблюдать правила асептики и антисептики.

Живые вакцины имеют длительный срок годности (1 год и более), их сохраняют при температуре 2-10 °С.

За 5-6 дней до введения живых вакцин и спустя 15-20 дней после вакцинации нельзя применять для лечения животных антибиотики, сульфаниламидные, нитрофурановые препараты и иммуноглобулины, так как они снижают напряженность и продолжительность иммунитета.

К живым вакцинам относятся следующие: сибиреязвенная (СТИ); сибиреязвенная из штамма 55; против бруцеллеза из штамма 19; против туберкулеза (БЦЖ); против паратифа свиней (ТС-177); против чумы плотоядных из штамма 668-КФ; против парагриппа-3 и инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота; сухая живая культуральная из штамма В-82 против миксоматоза кроликов; набор вакцин против трансмиссивного гастроэнтерита и ротавирусной болезни свиней (ТР-1); сухая культуральная вирус-вакцина против чумы плотоядных Вакчум; против чумы, гепатита, аденовироза, парвовирусного и коронавирусного энтеритов собак (вакцина Мультикан-4); ВГНКИ сухая культуральная против оспы птиц из куриного вируса и др.

Вакцины создают активный иммунитет через 7-21 день, который сохра­няется в среднем до 12 мес.

Убитые (инактивированные) вакцины. Для инактивации микроорганизмов применяют нагревание, обработку формалином, ацетоном, фенолом, ультрафиолетовыми лучами, ультразвуком, спиртом. Такие вакцины не опасны, они менее эффективны по сравнению с живыми, но при повторном введении создают достаточно стойкий иммунитет.

При производстве инактивированных вакцин необходимо строго контролировать процесс инактивации и в то же время сохранить в убитых культурах набор антигенов.

Убитые вакцины не содержат живые микроорганизмы. Высокая эффективность убитых вакцин связана с сохранением в инактивированных культурах микроорганизмов набора антигенов, обеспечивающих иммунный ответ.

Для высокой эффективности инактивированных вакцин большое значение имеет отбор производственных штаммов. Для изготовления поливалентных вакцин лучше всего использовать штаммы микроорганизмов с широким спектром антигенов, учитывая иммунологическое родство различных серологических групп и вариантов микроорганизмов.

Спектр возбудителей, используемых для приготовления инактивированных вакцин, очень разнообразен, но наибольшее распространение получили бактериальные (вакцина против некробактериоза) и вирусные (антирабическая инактивированная сухая культуральная вакцина против бешенства из штамма «Щелково-51».

Инактивированные вакцины должны храниться при температуре 2-8 °С.

Химические вакцины. Состоят из антигенных комплексов микробных клеток, соединенных с адъювантами. Адъюванты используют для укрупнения антигенных частиц, а также для повышения иммуногенной активности вакцин. К адъювантам относятся гидроксид алюминия, квасцы, органические или минеральные масла.

Эмульгированный или адсорбированный антиген становится более концентрированным. При введении в организм он депонируется и поступает с места введения в органы и ткани небольшими дозами. Медленная резорбция антигена пролонгирует иммунный эффект вакцины и существенно снижает ее токсичные и аллергические свойства.

К числу химических вакцин можно отнести депонированные вакцины про­тив рожи свиней и стрептококкозов свиней (серогрупп С и R).

Ассоциированные вакцины. Состоят из смеси культур микроорганизмов возбудителей различных инфекционных заболеваний, которые не угнетают иммунные свойства друг друга. После введения таких вакцин в организме животных формируется иммунитет против нескольких заболеваний одновременно.

К их числу можно отнести вакцину, ассоциированную против лептоспироза и парвовирусной инфекции свиней сухую культуральную ассоциированную вирусвакцину против болезни Ауески и чумы свиней Суибивак; ассоциированную вакцину против лептоспироза и эмфизематозного карбункула крупного рогатого скота и др.

Анатоксины. Это препараты, содержащие токсины, лишенные токсичес­ких свойств, но сохранившие антигенность. Их используют для индукции иммунных реакций, направленных на нейтрализацию токсинов.

Анатоксины производят из экзотоксинов различных видов микроорганизмов. Для этого токсины обезвреживают формалином и выдерживают в термостате при температуре 38-40 °С в течение нескольких дней. Анатоксины, по существу, являются аналогами инактивированных вакцин. Они очищены от балластных веществ, адсорбированы и концентрированы на гидрооксид алюминия. Адсорбенты вводят в анатоксин для усиления адъювантных свойств.

Анатоксины создают антитоксический иммунитет, который сохраняется тродолжительное время.

В настоящее время в ветеринарии используют анатоксин поливалентный против клостридиозов овец, столбнячный концентрированный и др.

Рекомбинантные вакцины. Используя методы генной инженерии, можно создавать искусственные генетические структуры в виде рекомбинантных (гибридных) молекул ДНК. Рекомбинантная молекула ДНК с новой генетической информацией вводится в клетку реципиента с помощью переносчиков генетической информации (вирусы, плазмиды), которые называются векторами.

Получение рекомбинантных вакцин включает в себя несколько этапов:

• клонирование генов, обеспечивающих синтез необходимых антигенов;

• введение клонированных генов в вектор (вирусы, плазмиды);

• введение векторов в клетки-продуценты (вирусы, бактерии, грибы);

• культивирование клеток in vitro; выделение антигена и его очистка или применение клеток-продуцентов в качестве вакцин.

Готовый продукт должен быть исследован в сравнении с естественным референс-препаратом или с одной из первых серий генно-инженерного пре­парата, прошедшего доклинические и клинические испытания (МедуницинН.В., 1999).

Б. Г. Орлянкин (1998) сообщает, что создано новое направление в разработке генно-инженерных вакцин, основанное на введении плазмидной ДНК (вектора) со встроенным геном протективного белка непосредственно в организм животного. В нем плазмидная ДНК не размножается, не встраивается в хромосомы и не вызывает реакцию образования антител. Плазмидная ДНК со встроенным геномом протективного белка индуцирует у животных полноценный клеточный и гуморальный иммунный ответ.

На базе одного плазмидного вектора можно конструировать различные ДНК-вакцины, меняя только ген, кодирующий протективный белок. ДНК-вакцины обладают безопасностью инактивированных вакцин и эффективностью живых. В настоящее время сконструировано более 20 рекомбинантных вакцин против различных болезней животных и человека: вакцина против бешенства, болезни Ауески, инфекционного ринотрахеита, вирусной диареи, респираторно-синцитиальной инфекции и лейкоза крупного рогатого скота, ринопневмонии лошадей, репродуктивного и респираторного синдрома свиней, болезни Марека и ньюкаслской болезни, синдрома снижения яйценоскости птиц, гриппа А, парвовирусной инфекции собак, гепатитов В и С, ВИЧ-инфекции, лимфоцитарного хориоменингита, Т-клеточного лейкоза человека, герпесвирусной инфекции человека, ротавирусной инфекции мышей и иммунодефицита кошек и др.

ДНК-вакцины (Юров Г. К., Народницкий Б. С, Юров К. П., 1999) по срав­нению с другими вакцинами обладают рядом преимуществ.

1.При разработке таких вакцин можно достаточно быстро получить рекомбинантную плазмиду, несущую в себе ген, кодирующий необходимый белок латогена, в отличие от длительного и дорогостоящего процесса получения аттенуированных штаммов возбудителя или трансгенных животных.

2.Технологичность и низкая себестоимость культивирования полученных плазмид в клетках Е. coli и ее дальнейшей очистки.

3.Экспрессируемый в клетках вакцинированного животного белок имеет конформацию, максимально близкую к нативной, и обладает высокой антигенной активностью, что не всегда достигается при использовании субъединичных вакцин.

4.Элиминация векторной плазмиды в организме вакцинированного живот­ного происходит за короткий промежуток времени.

5.При ДНК-вакцинации против особо опасных инфекций вероятность за­болевания животного в результате иммунизации полностью отсутствует.

6.Возможен пролонгированный иммунитет.

Все вышесказанное позволяет называть ДНК-вакцины вакцинами XXI в.

Однако мнение о полном контроле за инфекциями с помощью вакцин удерживалось до конца 80-х годов XX в., пока его не поколебала пандемия СПИДа (Супотницкий М. В., 1998)*.

ДНК-иммунизация также не является всеобщей панацеей. Со второй поло­вины XX в. все большее значение приобрели возбудители инфекций, которые невозможно контролировать с помощью иммунопрофилактики. Персистирование этих микроорганизмов сопровождается феноменом антителозависимого усиления инфекции или интегрированием провируса в геном макроорганизма. Специфическая профилактика может основываться на торможении проникновения возбудителя в чувствительные клетки путем блокирования рецепторов узнавания на их поверхности (вирусная интерференция, водорастворимые соединения, связывающие рецепторы) или путем ингибирования их внутриклеточного размножения (олигонуклеотидное и антисмысловое ингибирование генов возбудителя, уничтожение инфицированных клеток специфическим цитотоксином и др.).

Решение проблемы интегрирования провируса возможно при клонировании трансгенных животных, например, при получении линий, не содержащих провирус (по-видимому, то же относится и к животным, пораженным прионными болезнями). Следовательно, ДНК-вакцины следует разрабатывать в отношении возбудителей, персистирование которых не сопровождается антителозависимым усилением инфекции или сохранением провируса в геноме хозяина.

СЕРОПРОФИЛАКТИКА И СЕРОТЕРАПИЯ

Сыворотки(Serum) формируют в организме животных пассивный иммунитет, который сохраняется 2-3 мед, и используют для лечения больных животных или профилактики заболеваний в угрожаемой зоне.

В иммунных сыворотках содержатся антитела, поэтому их применяют чаще всего с лечебной целью в начале болезни, с тем чтобы достигнуть наибольшего лечебного эффекта у животных. Сыворотки могут содержать антитела против микроорганизмов и токсинов, поэтому они подразделяются на антимикробные и антитоксические.

Получают сыворотки на биофабриках и биокомбинатах путем двухэтапной гипериммунизации продуцентов иммуносывороток (лошадей, волов, овец, свиней, мулов, ослов). Гипериммунизацию проводят нарастающими дозами антигенов (вакцин) по определенной схеме. На первом этапе животным-продуцентам вводят вакцину (1-2 раза), а в дальнейшем по схеме в нарастающих дозах - вирулентную культуру производственного штамма микроорганизмов в течение длительного времени.

При завершении иммунизации продуцентов обескровливают, кровь от отстаивают, а сыворотку исследуют на стерильность и специфическую активность. При этом сыворотку подопытным животным вводят одновременно с логичными вирулентными микроорганизмами в летальных дозах или через некоторое время после заражения. В некоторых случаях при гипериммунизации животных антиген вводят в сочетании с адъювантами, которые способствуют повышению титра сывороток (алюмолиевые квасцы, гидроксид алюминия и пр.). При производстве антитоксических сывороток вначале продуцентов иммунизируют анатоксином, а затем вводят токсин.

Таким образом, в зависимости от иммунизирующего антигена различают

• антибактериальные,

• антивирусные,

• антитоксические сыворотки.

Известно, что антитела обезвреживают микроорганизмы, токсины или вирусы в основном до их проникновения в клетки-мишени. Поэтому при заболеваниях, когда возбудитель локализуется внутриклеточно (туберкулез, бруцеллез, хламидиоз и др.), пока не удается разработать эффективные методы серотерапии.

Сывороточные лечебно-профилактические препараты используют в основном для экстренной иммунопрофилактики или устранения некоторых форм иммунодефицита у животных.

С этой целью используют сыворотки или глобулины, полученные от животных, переболевших инфекционными болезнями или гипериммунизированных соответствующими профилактическими препаратами (лошадей, волов), например, противосибиреязвенный глобулин содержит комплекс γ- и β- глобулиновых фракций, полученных из сибиреязвенной сыворотки.

Такие препараты имеют ряд преимуществ перед нативными сыворотками, так как обладают большей специфичностью действия, менее реактогенны и вводятся животным в небольших объемах. При внутривенном введении сывороток и глобулинов невосприимчивость приобретается сразу после их введения. При подкожном или внутримышечном введении антитела в защитной концентрации в крови появляются через 12-24 ч.

Антитоксические сыворотки получают при иммунизации крупных животных возрастающими дозами антитоксинов, а затем и токсинов. Полученные сыворотки подвергаются очистке и концентрации, освобождаются от балластных белков, стандартизируются по активности.

Антибактериальные и антивирусные препараты получают гипериммунизацией лошадей соответствующими убитыми вакцинами или антигенами.

К недостатку действия сывороточных препаратов относится кратковременность формируемого пассивного иммунитета.

Гетерогенные сыворотки создают невосприимчивость на 1- 2 недели, гомологичные им глобулины - на 3-4 недели.