Векторы генной инженерии растений

Лекция 9 Векторы для трансформации растений и животных.

Введение генов в клетки млекопитающих.

Характеристика векторов для переноса генов в животные клетки

Манипуляции с клетками млекопитающих можно разделить на 2 большие группы: эксперименты с соматическим клетками и эксперименты по трансформации половых клеток. В последнем случае конечный результат – получение трансгенных организмов.

Характеристика векторов для переноса генов в животные клетки

Одними из лучших носителей для введения чужеродной информации в животную клетку являются вектора на основе ретровирусов, например, на основе вируса лейкоза мышей. Они обеспечивают высокоэффективный перенос генов и их стабильное встраивание в хромосому клеток-мишеней. В основном трансформации животных клеток осуществляют либо с помощью ретровирусов (около 40% от всех трансформаций), либо путем упаковки ДНК в липосомы (25%), реже используют аденовирусы, так как они могут вызывать сильный иммунный ответ, кроме того, невозможно их повторное введение.

Если проблема доставки чужеродной ДНК in vitro практически решена, а ее доставка в клетки-мишени разных тканей in vivo успешно решается (главным образом путем создания конструкций, несущих рецепторные белки, в том числе и антигены, специфичные для тех или иных тканей), то другие характеристики существующих векторных систем - стабильность интеграции, регулируемая экспрессия, безопасность — все еще нуждаются в серьезных доработках. Прежде всего это касается стабильности интеграции. До настоящего времени интеграция в геном достигалась только при использовании ретровирусных либо аденоассоциированных векторов. Повысить эффективность стабильной интеграции можно путем совершенствования генных конструкций типа рецептор-опосредованных систем, либо путем создания достаточно стабильных эписомных векторов (то есть ДНК-структур, способных к длительной персистенции внутри ядер).

В последнее время особое внимание уделяется созданию векторов на базе искусственных хромосом млекопитающих (MAC - mammalian artificial chromosomes). Благодаря наличию основных структурных элементов обычных хромосом такие мини-хромосомы длительно удерживаются в клетках и способны нести полноразмерные (геномные) гены и их естественные регуляторные элементы, которые необходимы для правильной работы гена, в нужной ткани и в должное время. Такие искусственные хромосомы уже созданы для дрожжей (YAK), так как геном дрожжей полностью картирован.

Для идентификации модифицированных клеток, необходимы маркеры. Если трансформируют соматические клетки, то применяют обычно селективные маркеры. Аксель с коллегами из колледжа терапии и хирургии Колумбийского университета исправили таким образом генетический дефект клеток мыши. Они взяли фрагмент ДНК, содержащий ген тимидинкиназы (ТК), который получен из вируса герпеса, смешали эту ДНК с несколькими миллиграммами ДНК-носителя из спермы лосося и осадили ДНК на культуру L-клеток мыши, в которых ген ТК отсутствовал (ТК-). С частотой 1 на 100000 клетки приобретали ген ТК, поэтому на селективной среде, которая не позволяла расти ТК- клеткам, росли и нормально размножались ТК+ - клетки.

Другой селективный маркер - ген, кодирующий дигидрофолатредуктазу (ДГФР), можно использовать при трансформации немутантных линий клетки. Благодаря экспрессии многих копий этого гена животная клетка вместе с плазмидой приобретает устойчивость к высоким концентрациям ингибитора фермента, и таким образом трансформантов можно отбирать при высоких концентрациях ингибитора.

Разработано еще два универсальных вектора, содержащих генные маркеры, работающие в нормальных клетках. Они построены по одному и тому же принципу: прокариотические гены, определяющие фенотип трансгенных клеток, соединены с эукариотическими регуляторными сигналами.

Один из векторов состоит из прокариотического гена устойчивости к антибиотику неомицину, встроенного в раннюю область генома SV-40. Эукариотические клетки чувствительны к аналогу неомицина G 418, который инактивируется продуктом гена. Таким образом клетки, прошедшие трасфекцию приобретают способность расти на среде, содержащей G 418.

Векторы генной инженерии растений

Потенциальные векторы могут быть классифицированы на три категории.
1. Векторы, полученные на основе растительных патогенов (вирусов, вироидов), которые характеризуются естественной способностью к введению в клетку чужеродной ДНК.
2. Векторы, полученные на основе мобильных генетических элементов. Их еще называют подвижные элементы, транспозируемые элементы, транспозоны. Транспозоны способны менять свою локализацию в геномах.

1. Векторы, полученные на основе природных растительных векторов. Представители Тi- или Ri-плазмида.

Вирусы. Среди растительных вирусов группа каулимовирусов – изометрических вирусов мозаики цветной капусты CaMV (Caulimoflower mosaic virus) рассматриваются наиболее часто как потенциальный вектор для введения чужеродной ДНК в растение. Это связано с тем, что CaMV являются вирусами растений, содержащими двунитевую ДНК, с которой легче всего манипулировать при использовании технологии рекомбинантных ДНК для их потенциального применения в качестве векторов. Геном CaMV имеет длину 8 тысяч пар нуклеотидов (т.п.н.) и ДНК обнаруживается в линейной, кольцевой, закрученной или завязанной в узел форме. Она обладает уникальными (один раз встречающимися в данной молекуле) сайтами для гидролиза эндонуклеазами SalGI и XhoI. Эти сайты могут быть использованы для превращения ДНК CaMV в линейную молекулу с последующим лигированием с подходящим плазмидным ветктором E. Coli, в результате чего образуется гибридная плазмида, которая может быть клонирована в E. сoli. Транскрипция генома CaMV ассиметрична – только α-нить продуцирует стабильные РНК-транскрипты. Перед С5' концом транскриптов найдены типичные эукариотические промоторные сигналы. Очевидно, синтез вирусной РНК осуществляется полимеразой хозяина. На интеграцию вирусной ДНК с геномом хозяина данных нет. CaMV инфекция не передается через семена и нет оснований думать, что происходит интеграция геномов вируса и растения.
Данный вирус поражает главным образом крестоцветные растения.
Нуклеотидные последовательности CaMV указывают на то, что обширные области генома кодирует белок. Чтобы встроить новую ДНК необходимо идентифицировать области, куда можно было бы внедрить нужные гены так, чтобы это не отражалось на интересующих исследователей областях. Есть сообщение об успешном внедрении экзогенных ДНК, в частности γ-ДНК в вирус и ее размножении в растениях. Принципиальный интерес к CaMV как вектору основан на том, что его ДНК может быть введена непосредственно в растение просто путем втирания в листья и вирус распространяется по всему растению. Это дает основание рассматривать возможности введения чужеродной ДНК в растение, а не в клеточную культуру.
Введение вирусной ДНК эффективно – нужно всего лишь 1-5 мкг клонированной ДНК на растение и почти 100% растений становятся инфицированными.
CaMV можно манипулировать in vitro как с бактериальной плазмидой и затем вводить в растение. Особым преимуществом CaMV является то, что он проникает во все клетки. К трудностям использования относится ограниченность круга хозяев.
В настоящее время привлекает внимание группа геминовирусов, содержащих однонитевую ДНК. Например, вирусы могут хорошо дополнять CaMV потому что имеют различный круг хозяев. Геминовирусы аккумулируются в ядрах растительных клеток и инфицируют многие сельскохозяйственные культуры – кукурузу, бобы, томаты, пшеницу, табак и многие тропические растения.

Вироиды. Около 40 лет назад считалось, что все инфекционные болезни растений и животных вызваны или микроорганизмами (бактерии, грибы) или вирусами. Было известно, что самые мелкие вирусы, способные к независимой репликации, имеют геномы с молекулярной массой 1 млрд. Поэтому резонно было предположить, что этот размер представляет собой минимальное количество информации, необходимой для кодирования вирусом своих продуктов и подавления метаболизма клетки-хозяина. Действительно, хотя и известны меньшие вирусы, они для репликации нуждаются в вирусах-помощниках, находящихся в той же клетке. Но в 1971 году было показано, что болезнь «веретенообразность клубней» картофеля вызвана небольшими неинкапсулированными молекулами автономно реплицирующейся РНК - вироидами. Оказалось, что вироиды вводят в хозяйскую клетку еще меньшую информацию.
Вироиды реплицируются за счет фермента хозяина механизмом типа катящихся колец с кольцевым вироидом в качестве матрицы.

Благодаря ряду особенностей вироиды рассматриваются в качестве потенциальных векторов:
1) вызывают инфекцию всего растения и могут сами мигрировать по растению;
2) переносятся через клеточный сок;

3) некоторые вироиды передаются через семена (значит, они интегрируются с геномом хозяина);

4) инфицируют широкий ряд растений.

Транспозоны. Одним из перспективных векторов для переноса генетической информации в растение является вектор, сконструированный на основе мобильных генетических элементов.

В 70-е годы прошедшего столетия в молекулярной генетике появилось новое понятие – нестабильность генома. Этому важнейшему феномену посвящена монография Р. Б. Хенсина «Непостоянство генома». Оказалось, что в геноме, считавшимся многие годы незыблемым, определенные сегменты ДНК могут менять свою локализацию, то есть мигрировать или, как еще принято говорить у генетиков, транспозировать. Однако это понятие ни в коей мере не отменяет основного постулата классической генетики о постоянстве генома.

Первая группа транспозирующихся элементов (ТЭ) получила название инсерционных последовательностей – это простые транспозоны, обозначаются IS с номерами.
Каждый IS обладает короткими инвертированными концевыми повторами, 15-25 пар нуклеотидов. Эти повторы представляют собой два участка одной и той же двунитевой ДНК, имеющие одинаковые нуклеотидные последовательности, но расположены в противоположной (обратной) ориентации. ДНК IS фланкирована очень короткими прямыми повторами. Мишень содержит до внедрения только один такой повтор (5 или 9 пар нуклеотидов). Наличие прямых и обратных повторов указывает на присутствие транспозона. Рамка считывания несет информацию о белках.
Сложные транспозоны обозначаются Tn c номерами. Один класс представлен сложными элементами, состоящими из центральной части, несущей маркер, например лекарственной устойчивости, фланкированной с каждой стороны родственными последовательностями – плечами – длинными концевыми повторами. Плечи могут иметь либо одинаково ориентированную, либо инвертированную последовательность. Иногда плечи состоят из IS элементов. В случае Tn₉ на каждом плече по IS₁. В других случаях плечи напоминают IS элементы.Все модули имеют концевые инвертированные повторы, поэтому сложный транспозон также заканчивается короткими инвертированными повторами. Если же плечи имеют инвертированную ориентацию друг относительно друга, короткие повторы на концах Tn идентичны.
Природа транспозиционного события состоит в разрезании сайта мишени рестриктазой, куда внедряется транспозон. Рестриктазы (рестрикционные эндонуклеазы) ферменты, разрезающие ДНК по определенным нуклеотидным последовательностям, которые они «узнают». Эти последовательности называются сайтами рестрикции. Образование и достройка ступенчатых концов делают понятными наличие прямых повторов ДНК мишени в сайте внедрения.

Рекомбинация между любой парой прямых повторов будет приводить к делеции, т.е. утрате ДНК между ними (Рис. 4). Промежуточная область вырезается в виде кольцевой ДНК. Хромосома сохраняет одну копиюпрямого повтора. В случае Т₉ (который заключен между двумя IS₁) рекомбинация приведет к замене Т₉ на IS₁.
В чем же заключается смысл предусмотренного природой процесса перемещения отдельных сегментов ДНК. В результате внедрения,
транспозоны прерывают соответствующий ген и он перестает функционировать. Таким образом, транспозоны играют значительную роль в эволюции. Кроме того, транспозоны несут в себе сигналы для начала считывания информации. Внедряясь в новые области ДНК, они изменяют процесс считывания информации. У бактерий ряд транспозонов несет гены устойчивости к антибиотикам. Они могут передаваться из одной клетки к другой. В результате, у данного вида возрастает число бактерий выживающих при высоких концентрациях антибиотика. В индивидуальном развитии высших организмов на определенных этапах происходит включение или выключение определенных программ. В этом ключевую роль также играют транспозоны. Можно считать экспериментально доказанным участие мигрирующих элементов в образовании опухолей.
Наибольшее применение в качестве векторов в настоящее время нашли плазмиды – внехромосомные, автономно реплицирующиеся, кольцевые молекулы ДНК бактерий. Почвенные бактерии или агробактерии содержат плазмидную ДНК, способную генетически трансформировать растительную клетку.
Агробактерии. Agrobacterium tumefaciens и Agrobacterium rhizogenes представляют собой почвенные бактерии, которые в участках повреждения двудольных растений вызывают заболевания, называемые соответственно «корончатым галлом» и «косматым корнем». Среди однодольных растений только некоторые представители семейств Liliaceae и Amaryllidaceae оказались в слабой степени восприимчивы к заболеванию корончатых галлов. Причины подобного ограничения круга хозяев в настоящее время не раскрыты. Однажды начавшись, опухолевый рост может продолжаться и в отсутствие бактерий, а опухолевая ткань способна расти в асептичных условиях в культуре на питательной среде, не содержащей экзогенных аук­синов и цитокининов, которые в норме необходимы для стимляции роста растительных тканей in vitro.
Опухолевые ткани синтезируют новые производные аминокислот и сахаров, известные как опины. Тип опина, синтезируемого в опухоли (например нопалин, октопин, агроцинопин, маннопин и агропин), зависит от штамма агробактерий, вызвавшего ее образование. Октопин и нопалин – опины – образуются из аргинина; их легче всего обнаружить в ткани корончатых галлов. В соответствии с этим многие широко распространенные штаммы Agrobacterium tumefaciens классифицируют как штаммы октопинового или нопалинового типа. В опухолях косматого корня, вызываемых A. rhizogenes,как правило, обнаруживается агропин. Штаммы агробактерий, вызывающие образование опухолей, способны к избирательному катаболизму опинов того типа, синтез которых индуцируют, используя последние в качестве источников углерода и азота.

Как индукция опухолей, так и синтез опинов обусловлены бактериальными плазмидами.
Ti-плазмиды. Ti-плазмиды (от англ. Tumour inducing – образующие опухоль), обнаруженные (рис. 5. А) во всех вируленных штаммах A. tumefaclvns, имеют размеры около 200—250 тыс. пар нуклеотидов (т. п. н.) и стабильно сохраняются в агробактериях при температуре ниже 30°С. Согласно данным ДНК-ДНК-гибридизации в Ti-плазмидах различных штаммов агробактерий имеются четыре области гомологии. Генетический анализ показал, что две области, Т-ДНК (от англ. Transferred) и vir-область (от англ. virulence), связаны с опухолеобразованием, тогда как две другие вовлечены в конъюгационный перенос и репликацию плазмид в клетках агробактерий.

В процессе опухолеобразования определенная последовательность Ti-плазмиды, Т-ДНК, переносится в клетки растения и встраивается в их ядерный геном без заметных перестроек. Т-ДНК стабильна в растительном геноме. В растительную ДНК может включаться одна или более копий Т-ДНК, и хотя множественные копии Т-ДНК могут образовывать тандемные повторы, они могут быть разбросаны по геному - сцеплены с различными районами растительной ДНК. Место встраивания Т-ДНК в растительную ДНК, по-видимому, случайно. В различных Ti-плазмидах найдены области, гомологичные Т-ДНК. В обычно используемых напалиновых штаммах A. tumefaciens размер области Т-ДНК составляет около 24 т. п. н. В некоторых корончатых галлах октопинового типа выявлены два несмежных сегмента T_L (Т-левая Т-ДНК) и Т_R (Т-правая). Последовательность Т_L (14 т.п.н.) обнаружена во всех линиях трансформированных клеток. T_R (7 т. п. н.), которая происходит из района Ti-плазмиды, локализующегося правее Tl-ДНК, обнаружена в некоторых опухолевых линиях, причем число ее копий может отличаться от такового для Т_L . Последнее обстоятельство указывает на независимость процессов переноса T_L и T_R.
В опухолевых клетках Т-ДНК транскрибируется с образованием различных полиаденилированных мРНК. количество накапливающихся в клетках транскриптов Т-ДНК относительно невелико по сравнению с другими растительными мРНК, а относительное их содержание может быть различным. Определение нуклеотидной последовательности Т-ДНК нопалинового типа позволило идентифицировать 13 протяженных открытых рамок считывания, тогда как в октопиновых T_L- и T_R-ДНК обнаружено соответственно 8 и 6 протяженных открытых рамок. Транскрипты правой части нопалиновой т-днк функционально эквивалентны транскриптам tl-днк.общая организация генов Т-ДНК и их фланкирующих областей (последовательностей ДНК расположенных с обеих сторон генов) сходна с таковой эукариотических генов, хотя они не содержат интронов. один из генов октопиновой T_L- области (транскрипт 3) кодирует октопинсинтазу (ocs). В нопалиновых плазмидах гены опинсинтаз включают и гены нопалинсинтазы и агроцинопинсинтазы (acs). В октопиновых Тi-плазмидах TR-ДНК o6ласть кодирует два белка, ответственных за синтез маннопина, и один — за превращение маннопина в агропин. Локус tmr (транскрипт 4) кодирует фермент, участвующий в синтезе цитокинина; мутации в этом локусе приводят у некоторых растений к пролиферации корней из ткани корончатых галлов («rooty» или «корневые» мутанты). Локус tms1 и tms2 (транскрипты 1 и 2) определяют нерегулируемый синтез ауксинов, и мутации в любом из них у многих типов растений обусловливают появление побегов из ткани корончатых галлов («snooty» или «побеговые» мутанты). Таким образом, Т-ДНК содержит гены (tms 1, tms2 и tmr), продукты которых препятствуют нормальной регуляции метаболических процессов, вовлеченных в синтез фитогормонов, что и приводит к онкогенному фенотипу. Следовательно, эти гены (tms 1, tms2 и tmr) можно отнести к так называемым онкогенам, т.е генам, индуцирующим образование опухоли. однако следует отметить, что входящие в состав Т-ДНК гены не участвуют в переносе Т-ДНК в растительные клетки и не влияют на её стабильность в геноме растения.

Ri–плазмиды. Индукция заболевания косматого корня бактериями A. rhizogenes аналогична трансформирующему действию A. tumefaciens. Под контролем vir-области две отдельные области Т-ДНК плазмиды переносятся в растительный геном T_L- и T_R.. T_R-ДНК содержит гены, кодирующие опины (маннопин или агропин), и, соответственно этому, штаммы характеризуют по их специфическим опиновым генам. T_R-ДНК, кроме того, содержит два гена, кодирующие ауксин. Эти гены в значительной степени гомологичны ауксиновым генам A. Tumefaciens. T_L Т-ДНК A. rhizogenes полностью секвенирована; она содержит по крайней мере 11 открытых рамок считывания, сходных с эукариотическими, которые снабжены необходимыми элементами промоторов и сигналами полиаденилирования (последние должны функционировать после переноса в растительный геном).Для поддержания фенотипа косматого корня нет абсолютной необходимости в T_L, однако штаммы Agrobacterium, несущие как T_L, так и Т_R, более вирулентны и заражают большее число видов растении, чем штаммы, несущие только одну Т-ДНК.