Ферменты. Классификация. Регуляция активности

 

Ферменты (E) – биокатализаторы, представляющие собой соединения белковой природы. Это могут быть простые или сложные белки (содержащие неаминокислотные компоненты).

Ферменты снижают энергию активации (Е_А), что позволяет протекать реакциям при физиологических условиях, со скоростями более, чем в 10¹⁰ раз (300 лет – 1 сек). За каждое превращение одного метаболита отвечает индивидуальный фермент. Основное свойство ферментов – распознавать определённые метаболиты, катализировать их превращение и обеспечивать регуляцию каталитической активности. Таким образом, ферменты характеризуются субстратной специфичностью и специфичностью действия.

Катализируемые ферментами реакции начинаются со связывания определённого метаболита – субстрата (S) с ферментом. Каждый фермент, как правило, взаимодействует лишь с одним субстратом и катализирует его превращение до установления равновесия:

E + S↔ ES ↔ EP ↔ E + P

Узнавание субстрата происходит в процессе связывания его с ферментом. Молекулы субстрата присоединяются в определённом месте молекулы фермента – каталитическом или активном центре (АЦ). АЦ фермента и субстрат подходят друг к другу как ключ к замку (стерические свойства субстрата, распределение зарядов на его молекуле).

К аминокислотам часто играющим важную роль в активном центре фермента, относятся серин (ОН-группа) и гистидин (N-имидазольного кольца).

Коферменты и простетические группы. В связывании и последующем переносе отдельных фрагментов субстрата (например, Н^×) наряду с ферментами участвуют низкомолекулярные соединения – коферменты и простетические группы.

Коферменты (косубстраты или переносчики) связываются с молекулой фермента обратимо – присоединяют фрагмент субстрата на ферменте, а затем отделяются от него, чтобы передать этот фрагмент на другом ферменте второму соединению:

Ф₁-К + S ↔ Ф1-К-S ↔ K-S +Ф₂ ↔ Ф₂-К-S ↔ Ф₂ + К + Р

Простетические группы (ионы металлов) прочно связаны с молекулами ферментов и не отделяются во время присоединения субстрата и переноса фрагментов.

Многие высшие организмы не способны синтезировать коферменты – получают их с пищей в виде витаминов (потребность в них составляет несколько мг в сут):

 

Кофермент	Функция	Витамин
Пиридоксальфосфат	Переаминирование; декарбоксилирование; рацемизация	Пиридоксин (В6)
Тиаминпирофосфат	Аэробное декарбоксилирование; перенос альдегидных групп	Тиамин (В1)
Кофермент А (КоА)	Перенос ацилов; аэробная деградация жирных кислот и их синтез	Пантотеновая кислота
Тетрагидрофолиевая кислота	Перенос С1-групп	Фолиевая кислота
Биотин	Перенос СО2	Биотин (Н)
NAD+	Перенос Н+ и е-	Никотиновая кислота
NADP+	Перенос Н+ и е-	Никотиновая кислота
FMN	Перенос Н+ и е-	Рибофлавин (В2)
FAD	Перенос Н+ и е-	Рибофлавин (В2)

 

Пиридиннуклеотиды. Никотинамидадениндинуклетид (NAD⁺) и никотинамидадениндинуклеотидфосфат (NAD(P)⁺):

Группой, определяющей функцию этих коферментов, является амид никотиновой кислоты: перенос Н⁺ с субстрата вместе с парой электронов (в виде гидрид-иона Н^× на пиридиновое кольцо, второй атом водорода в виде Н⁺ переходит в раствор). Рисунок (схема):

 

 

СН₃СН₂ОН + NAD⁺ ↔ СН₃СООН + NAD×Н₂

 

При 340 нм у NAD×Н₂ наблюдается максимальное поглощение.

 

Этот перенос стереоспецифичен: так алкогольдегидрогеназа и лактатдегидрогеназа переносят атом водорода на одну сторону пиридинового кольца, а глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа на другую.

Восстановленная форма NAD×Н₂ отсоединяется от одного фермента и передаётся на другой, где участвует в восстановлении S или направляется в дыхательную цепь. NAD(Р)×Н₂ участвует главным образом в восстановительных этапах биосинтеза.

 

Номенклатура ферментов. Название фермента складывается из:

1. Названия субстрата с прибавлением суффикса -аза (аргиназа, фосфатаза – гидролиз соответствующей группы);

2. Названия реакции с добавлением суффикса -аза (дегидрогеназа – отрыв Н^×, гидролаза, трансфераза).

Кроме того, используют:

-тривиальные названия ферментов (трипсин, пепсин, каталаза);

-систематические названия ферментов (в 1972 г. комиссией по номенклатуре биохимических соединений Международного союза теоретической и прикладной химии (IUPAC) опубликованы новые «Правила наименования ферментов». Согласно этим правилам ферменты нумеруются следующим образом: первая цифра указывает на класс, к которому относится фермент; вторая – характеристика реакции; третья – последующие детали.

Например, фермент 2.1.2. – трансфераза, переносящая одноуглеродные остатки – метильные.

Классификация ферментов. По типу каталитической реакции ферменты подразделяют на 6 классов: оксидоредуктазы; трансферазы; гидролазы; лиазы; изомеразы; лигазы (синтетазы).

1. Оксидоредуктазы – участвуют в окислительно-восстановительных реакциях (переносят Н⁺ или электроны). В их состав входят коферменты. Они подразделяются в соответствии с донором или акцептором е^--.

2. Трансферазы – осуществляют перенос групп атомов (СН₃, СООН, NH₂, SO₄, СНО, РО₄) с помощью специальных переносчиков – коферментов.

3. Гидролазы – осуществляют гидролитическое расщепление субстрата. Название фермента строится в соответствии с типом разрываемой связи (пептидгидролазы, глюкозидазы).

4. Лиазы – негидролитически отщепляют от субстрата группы с образованием двойной связи или присоединением по двойной связи СО_2, Н₂О, NH₃ групп_.

5. Изомеразы – катализируют превращения изомеров, в т.ч. рацемизацию, цис-транс, перемещение двойной связи, обмен групп у ассиметрического атома углерода, перемещение фосфатной группы.

6. Лигазы – осуществляют синтез за счёт макроэргических связей (АТФ) (а также биотин в реакциях карбоксилирования).

Активность ферментов. Стандартная единица активности — количество фермента, которое катализирует превращение 1 мкмоль субстрата в минуту при стандартных условиях (на русском и немецком – Е, на английском, французском, итальянском, испанском – U). Для некоторых высокомолекулярных веществ (белки, полисахариды) количество мкмоль субстрата определить нельзя – используют микроэквивалент участвующих в реакции групп. Для белка это это количество образовавшихся свободных -СООН или -NH₃ групп. Для полисахаридов – число прогидролизованных гликозидных связей.

Молекулярная активность – число мкмоль субстрата или эквивалентов, затронутых реакцией групп прореагировавших в течение 1 мин с 1 ммоль фермента или число стандарных единиц активности, содержащихся в 1 ммоль фермента.

Регуляция активности ферментов в клетке. В интактной клетке все протекающие биохимические реакции регулируются. Это обеспечивает экономичное использование питательных веществ, предупреждает избыточный синтез метаболитов и позволяет клетке адаптироваться к условиям окружающей среды (изменяется скорость синтеза конкретных метаболитов).

Так как реакции в клетке катализируются ферментами, регуляция метаболизма сводится к регуляции интенсивности ферментативных реакций за счёт изменения активности ферментов и их количества в клетке.

Регуляция активности ферментов. Активность ферментов зависит от фихических и химических факторов. Физические факторы (температура, давление, излучение, электромагнитное поле) менее специфичны, чем химические. Механизм действия химических факторов может быть основан: на связывании определённых групп (субстрат, кофакторы, ингибиторы) с АЦ фермента; взаимодействии со специальными участками на поверхности фермента (отличными от АЦ).

Активность некоторых ферментов регулируется путем химической модификации (ковалентное обратимое связывание с ферментом определенной группировки). Например, присоединение к глутаминсинтетазе E. coli остатка адениловой кислоты приводит к снижению активности фермента:

 

глутаминсинтетаза + АМФ ↔ глутаминсинтетаза-АМФ

 

Аналогичный механизм ацетилирования (деацетилирования) характерен для цитратлиазы фотосинтезирующих бактерий Rhodopseudomonas gelatinosa (активна ацетилированная форма фермента).

Наиболее быстрым и точным является механизм регуляции определенного типа ферментов – аллостерических. Они занимают ключевые позиции в обмене веществ (располагаются вначале метаболических путей, местах их разветвлений или в местах схождения):

 

1. А → В → С → D → Е → F

 

2. А → В → С → Е

→ D → F

 

3. А →

В → D → Е → F

С →

 

Термин аллостерическое ингибирование введен в 1961 г. Ж. Моно и Ф. Жакобом для того, чтобы подчеркнуть особенность данного типа регуляции – ингибитор взаимодействующий с ферментом, структурно отличается от субстрата.

Аллостерические ферменты – белки с высокой молекулярной массой, состоящие из нескольких субъединиц одного или нескольких типов (общее свойство – содержат регуляторный центр). В первом случае субъединицы содержат каталитический и регуляторный центры. Регуляторный центр называется аллостерическим. Во втором – одни субъединицы содержат каталитический, а другие регуляторный центр. В том и другом случае эти центры разделены пространственно, но функционально связаны.

С аллостерическим центром связываются определенные метаболиты – эффекторы (модуляторы, модификаторы). Ими могут быть субстраты и некоторые конечные продукты метаболических путей. Если действие эффектора приводит к снижению активности фермента – отрицательный эффектор (ингибитор). Положительный эффектор – активатор усиливает активность фермента.

 

Регуляторное действие связано с начальными этапами ферментативных реакций – образования фермент-субстратного комплекса (изменение сродства фермента к субстрату в результате конформационных изменений (изменение третичной структуры фермента).

Случаи аллостеричекой регуляции.

1. Регуляция первого фермента неразветвлённого пути биосинтеза конечным продуктом (наиболее простой):

 

А →^Ф1В →^Ф2 С →^Ф3 D →^Ф4 Е →^Ф5 F

 

 

В этом случае если продукт накапливается в клетке в избытке он ингибирует активность первого фермента биосинтетического пути – ретроингибирование. Используется клеткой для синтеза некоторых аминокислот. Например, при синтезе L-изолейцина (пять последовательных ферментативных реакций). Аллостерический фермент – треониндезаминаза.

2. Регуляция первого фермента разветвлённого пути биосинтеза. Для разветвлённых путей биосинтеза механизм регуляции по принципу обратной связи усложняется – перепроизводство одного из продуктов пути не должно ингибировать синтез остальных. В регулировании активности принимают участие все конечные продукты разветвлённого пути. Аллостерический фермент имеет несколько аллостерических центров, а каждый конечный продукт выполняет роль эффектора. Например, синтез аминокислот семейства аспартата.

В случае разветвлённого пути возможны следующие варианты регуляции:

-каждый эффектор в отдельности не влияет на активность аллостерического фермента – мультивалентное ингибирование;

-каждый эффектор вызывает частичное ингибирование активности аллостерического фермента – кумулятивное (аддитивное) ингибирование;

-активность начального фермента ингибируется промежуточным продуктом, накопление которого контролируется конечными продуктами – последовательное ингибирование.

Некоторые аллостерические ферменты существуют в клетке в виде изоферментов – катализируют одну реакцию, а их активность контролируется различными продуктами в результате отличия в аллостерических центрах. Это позволяет конечным продуктам независимо друг от друга ингибировать активность «своего» изофермента. Это наиболее совершенный механизм регуляции путей биосинтеза.

Регуляция синтеза ферментов в клетке. В основном это регуляция на уровне транскрипции (возможна также регуляция на уровне трансляции, посттрансляционные процессы, регуляция распада ферментов). Этот тип регуляции основан на том, что «считывание» информации, заложенной в генах происходит избирательно и скорость синтеза мРНК, а следовательно и дальнейшая трансляция, находятся под сложным механизмом контроля.

Все ферменты можно подразделить (по скорости синтеза) на конститутивные и индуцибельные. Синтез конститутивных ферментов происходит с постоянной, не зависящей от условий среды, скоростью. Эти ферменты присутствуют в клетке постоянно. Количество индуцибельных ферментов может существенно изменяться в зависимости от наличия в среде определённых веществ (субстратов). При отсутствии в среде субстратов их содержание в клетке минимально (несколько молекул), а при их наличии оно возрастает до нескольких процентов. Такой тип регуляции характерен для катаболических ферментов. Для ферментов, участвующих в анаболизме, характерна репрессия их синтеза конечным продуктом (при накоплении в клетке продукта ферментативных реакций количество ферментов падает), а при снижении концентрации конечного продукта происходит дерепрессия синтеза фермента (аналогична явлению индукции катаболических фрментов).

Репрессия синтеза фермента конечным продуктом. Данный тип регуляции характерен для большинства анаболических ферментов. Он осуществляется белками-репрессорами, а факторы, модифицирующие их активность – эффекторы (конечные и промежуточные продукты биосинтетических путей). Информация о структуре репрессоров заложена в генах-регуляторах.

Репрессор – аллостерический белок, который имеет центр связывания с эффектором и центр связывания с определённым участком ДНК – геном-оператором. Гены-регуляторы расположены на некотором расстоянии от структурных генов. В бактериальных хромосомах структурные гены часто объединяются в группы, которые находятся под контролем одного гена-оператора – опероны или под контролем одного гена-регулятора – регулоны. Гены, объединённые в регулон могут находиться в разных участках бактериальной хромосомы. Например, структурные гены, ответственные за синтез аргинина у E. coli.

Репрессия синтеза ферментов. Рисунок (схема):

 

 

 

Индукция синтеза ферментов. Индукция синтеза ферментов лактозного оперона. Рисунок (схема):

 

 

 

Катаболитная репрессия. В случае катаболитной репрессии быстро используемый клеткой субстрат способен подавлять синтез ферментов других путей катаболизма, участвующих в превращении сравнительно медленно используемых источников углерода и энергии. Например, при наличии в среде одновременно глюкозы и лактозы, клетки E. coli сначала используют глюкозу, а транскрипция лактозного оперона начинается тогда, когда вся глюкоза в среде будет использована. Это связано с наличием в клетке циклического АМФ (3¢,5¢цАМФ):

 

АТФ ® цАМФ + ФФ_н (реакция катализируется мембрансвязанным ферментом – аденилатциклазой)

 

цАМФ способен связываться с низкомолекулярным белком – катаболитным активатором, который в свободном состоянии не активен. Комплекс цАМФ-катаболитный активатор присоединяется к промотору лактозного оперона, повышая сродство РНК-полимеразы к промотору. Количество цАМФ зависит от того фосфорилированы ли белки-переносчики глюкозы. При отсутствии глюкозы в среде они фосфорилированы и в этом состоянии повышают активность аденилатциклазы. Дефосфорилированные переносчики снижают активность аденилатциклазы.