Постановка реакции для определения «золотого числа»

Обязательным этапом конструирования иммунохротографических тест-систем является определение «золотого числа», т.е. минимального защитного количества гидрофильного полимера, способного адсорбироваться на поверхности 10 мл золя золота и предотвращать его коагуляцию при добавлении к нему 1 мл 10% раствора NaCl. Оценка адсорбционной способности также может характеризовать кондиционность, приготовленных наночастиц коллоидного золота [1].

При постановке реакции использовали серии КЗ № 10, 10/1, 12, 12/1 и МкАт 1811 и 387 («Биалекса», Россия) с концентрацией белка 4,5 мг×см^-3 и 8,0 мг×см^-3 соответственно. Разведения антител и постановку реакции проводили в 96-луночных круглодонных полистероловых планшетах на наиболее часто используемом для этих целей, по данным литературы, 0,005 М карбанатно-бикарбонатном буфере [….].

0,005 М карбанатно-бикарбонатный буфер (КББ) готовили из 0,2 М КББ с рН 9,0-9,5 ЕД.

Приготовление 0,2 М КББ с рН 9,0-9,5 ЕД:

· 1 М (К₂CO₃) = 138,2 г на 1 л – 1 М раствор;

27,64 г на 1 л – 0,2 М раствор;

2,764 г на 100 мл – 0,2 М раствор;

· 1 М (NaHCO₃) = 84 г на 1 л – 1 М раствор;

16,8 г на 1 л – 0,2 М раствор;

1,68 г на 100 мл – 0,2 М раствор;

0,168 г на 10 мл – 0,2 М раствор.

Путем добавления к 0,2 М раствору NaHCO₃ 0,2 М раствора К₂CO₃ получали раствор карбонатно-бикарбонатного буфера с рН 9,5 ЕД.

Из 0,2 М КББ готовили 5 мМ раствор КББ путем разведения 0,2 М раствора КББ в 40 раз: 1 часть 0,2 М КББ (250 мкл) + 39 частей деионизированной воды (9750 мкл).

Все растворы для постановки реакции для определения «золотого числа» фильтровали через шприц-насадку с размером пор 0,22 µ.

Разведение МкАт (1811 и 387) для постановки реакции.

МкАт 1811 с исходной концентрацией 4,5 мг×см^-3 разводили на 0,005 М КББ до 200 мкг×см^-3. Для приготовления 800 мкл антител с концентрацией 200 мг×см^-3, предназначенных для тестирования, 35,55 мкл антител с исходной концентрацией 4,5 мг·см^-3 добавляли к 764,45 мкл 0,2 М карбонатно-бикарбонатного буфера с pH 9,0 ЕД.

МкАт 387 с исходной концентрацией 8,0 мг×см^-3 разводили на 0,005 М КББ до 200 мкг×см^-3. Для приготовления 250 мкл антител с концентрацией 200 мкг×см^-3, предназначенных для тестирования, 6,25 мкл антител с исходной концентрацией 8 мг·см^-3 добавляли к 243,75 мкл 0,2 М карбонатно-бикарбонатного буфера с pH 9,0 ЕД.

Постановка реакции. Для постановки реакции с целью определения золотого числа (ЗЧ) использовали два планшета: планшет № 1 – определение ЗЧ для МкАт 1811, планшет № 2 – определение ЗЧ для МкАт 387. Реакцию с каждой серией КЗ ставили в 2 повторностях. Ниже представлен алгоритм постановки реакции с МкАт 1811 и сериями КЗ № 10, 10/1, 12, 12/1 в планшете № 1:

1. Все серии КЗ доводили 0,2 М К₂CO₃ до рН 9,5 ЕД.

2. Во все лунки восьми горизонтальных рядов 96-луночного круглодонного пиолистеролового планшета вносили по 100 мкл 0,005 М карбонатно-бикарбонатного буфера с pH 9,5 ЕД;

3. В первые лунки планшета (А1-Н1) вносили по 100 мкл раствора МкАт 1811 с концентрацией 200 мкг·см^-3, при этом конечная концентрация антител в лунках А1-Н1 при добавлении их к 100 мкл буфера составила
100 мкг·см^-3;

4. Далее титровали содержимое лунок А1-Н1 слева направо с шагом два путем переноса 100 мкл раствора МкАт из каждой предыдущей лунки в каждую последующую. Таким образом, концентрация МкАт составила в лунке А1 – 100 мкг·см^-3, в А2 – 50 мкг·см^-3, в А3 – 25 мкг·см^-3, в А4 – 12,5 мкг·см^-3, в А5 – 6,25 мкг·см^-3, в А6 – 3,125 мкг·см^-3, в А7 –
1,5 мкг·см^-3 (принята за 0 мкг·см^-3). Аналогичным образом менялась концентрация антител в лунках горизонтальных рядов В-Н.

5. В каждую лунку двух горизонтальных рядов (в 2-х повторностях) вносили по 100 мкл КЗ, не задевая носиком содержимое лунок: в лунки рядов А-В – КЗ №10, С-D – №10/1; E-F – 12; G-H – №12/1;

6. Содержимое лунок инкубировали 15 мин;

7. По окончанию инкубации в каждую лунку вносили по 22 мкл 10%-ного раствора натрия хлорида. Конечная концентрация NaCl в каждой лунке при этом составила 1%;

8. Содержимое лунок перемешивали справа налево;

9. Инкубировали 10 мин.

Аналогичным образом проводили постановку реакции в планшете № 2 с МкАт 387.

Результаты постановки реакции определяли визуально и на спектрофотометре.

При визуальной оценке за «золотое число» принимали концентрацию антител в лунке, имеющей стабильную розовую окраску (где отсутствовало изменение цвета с розового на голубой-синий).

Результаты визуальной оценки реакции определения ЗЧ для МкАт 1811 с сериями КЗ № 10, 10/1, 12, 12/1 представлены в таблице 2.

Таблица 2 – Результаты визуальной оценки реакции определения ЗЧ для МкАт 1811 и 387 с сериями КЗ № 10, 10/1, 12, 12/1.

Серия КЗ	Золотое число для МкАТ 1811 / 387 определено в лунке (1) и соответствует концентрации МкАт (2), мкг·см-3
		3,125		12,5
10/1		6,25		25,0
		3,125		12,5
12/1		6,25		25,0

 

Кроме визуального определения «золотого числа» оценивали оптическую плотность содержимого лунок на планшетном спектрофотометре, измеряя ее при длине волны λ = 630 нм. По результатам определения строили кривую зависимости оптической плотности содержимого лунок от концентрации антител.

На графике определяли точку выхода на плато (х мкг·см^-3).

 

концентрация МкАТ, мкг·см-3

Рис. 1 – Результаты определения «золотого числа» для МкАт 387 и 1811 с серией КЗ № 10/1 при постановке реакции на 0,005 М КББ.

Из данных, представленных на рисунке 1, следует, что точка выхода на плато соответствует концентрация МкАт: для МкАт 1811 – 3,125 мкг·см^-3 , для МкАТ 387 – 12,5 мкг·см^-3.

По результатам визуальной оценки и спектрофотометрии были определены серии КЗ с наибольшей адсорбционной способностью – №10/1 и 12/1, а также выбраны МкАт 387 для последующей посадки на наночастицы КЗ соответствующих серий препаратов.

Для МкАт 387 был выбран диапазон концентраций антител от
25 мкг·см^-3 до 7 мкг·см^-3 , в пределах которого провели раститровку антител с шагом 2 мкг·см^-3 с целью определения более точного значения концентрации антител для приготовления конъюгата с КЗ.

Приготовление концентраций МкАт отличающихся друг от друга на
2 мкг·см^-3 в диапазоне от 25 мкг·см^-3 до 7 мкг·см^-3 проводили в эппендорфах в объеме, необходимом для постановки реакции с сериями КЗ № 10/1 и 12/1. Для этого:

а) готовили необходимый объем раствора МкАт с концентрацией
25 мкг·см^-3. Для этого к 15,625 мкл раствора МкАТ с исходной концентрацией 8 мкг·см^-3 добавляли 4984,375 мкл 0,005 М КББ;

б) в первый эппендорф вносили 450 мкл, а в остальные 9 по 400 мкл раствора МкАТ с концентрацией 25 мкг·см^-3;

в) для получения концентрации антител 23, 21, 19, 17, 15, 13, 11, 9, 7 мкг·см^-3 , начиная со 2-го эппендорфа, вносили 0,005 М КББ в объеме 36, 76, 128, 188, 268, 368, 508, 712, 1028 мкл, соответственно.

Далее проводили постановку реакции с целью определения «золотого числа» в планшетах:

1. Вносили в лунки А1-D1 первого вертикального ряда по 100 мкл МкАт с концентрацией 25 мкг·см^-3, в лунки А2-D2 второго вертикального ряда по 100 мкл МкАт с концентрацией 23 мкг·см^-3 , в лунки А3-D3 третьего вертикального ряда по 100 мкл МкАт с концентрацией 21 мкг·см^-3 , в лунки А4-D4 четвертого вертикального ряда по 100 мкл МкАт с концентрацией 19 мкг·см^-3, в лунки А5-D5 пятого вертикального ряда по 100 мкл МкАт с концентрацией 17 мкг·см^-3, в лунки А6-D6 шестого вертикального ряда по 100 мкл МкАт с концентрацией 15 мкг·см^-3 , в лунки А7-D7 седьмого вертикального ряда по 100 мкл МкАт с концентрацией 13 мкг·см^-3; в лунки А8-D8 восьмого вертикального ряда по 100 мкл МкАт с концентрацией 11 мкг·см^-3, в лунки А9-D9 девятого вертикального ряда по 100 мкл МкАт с концентрацией 9 мкг·см^-3 , в лунки А10-D10 десятого вертикального ряда по 100 мкл МкАт с концентрацией 7 мкг·см^-3.

2. В каждую лунку двух горизонтальных рядов (в 2-х повторностях) вносили по 100 мкл КЗ, не задевая носиком содержимое лунок: в лунки рядов А-В – КЗ 10/1, С-D – 12/1.

3. Содержимое лунок инкубировали 15 мин.

4. По окончанию инкубации в каждую лунку вносили по 22 мкл 10%-ного раствора натрия хлорида. Конечная концентрация NaCl в каждой лунке при этом составила 1%.

5. Содержимое лунок перемешивали справа-налево.

6. Инкубировали 10 мин.

Результаты постановки реакции определяли визуально и на спектрофотометре, измеряя спектр содержимого лунок планшета при длине волны λ = 630 нм.

По результатам спектрофотометрии строили кривую зависимости оптической плотности содержимого лунок от концентрации антител. На графике определяли точку выхода на плато (х мкг·см^-3). Золотое число определяли как х + 15% [87].

 

концентрация МкАТ, мкг·см-3

Рис. 2 – Зависимость спектра поглощения от концентрации МкАТ при длине волны 630 нм при титровании антител в диапазоне от 25 мкг·см^-3 до 12,5 мкг·см^-3 с интервалом 2 мкг·см^-3.

Из данных, представленных на рисунке 2, следует, что «золотое число» (точка выхода графика на плато) для МкАТ 387 и серии КЗ № 10/1 соответствует 17 мкг·см^-3, для МкАТ 387 и серии КЗ № 12/1 соответствует
19 мкг·см^-3. С учетом данных литературы [87] необходимая концентрация для конъюгации соответствующих антител должна составлять плюс 15 % к концентрации, определенной по результатам оценки «золотого числа», соответственно, 19,5 мкг·см^-3 и 23,0 мкг·см^-3.

 

2.2.3 Результаты экспериментального обоснования состава
конъюгата коллоидного золота с антителами для разработки
иммунохроматографической тест-системы, предназначенной для
идентификации Helicobacter pylori

В результате проведенных исследований теоретически обоснована и экспериментально отработана методика приготовления наночастиц КЗ с диаметром 30 нм.

Для получения кондиционного коллоидного золота с размером частиц 30 нм необходимо:

1) приготовить 50 мл 1% раствора 5,5-водного цитрата натрия: 0,69 г 5,5-водного цитрата натрия растворить в 50 мл деионизированной воды;

2) приготовить 10% раствор золохлористоводородной кислоты (HAuCl₄·3H₂O): к 1 г HAuCl₄ добавить 10 мл деионизированной воды;

3) в колбу Эрленмейера добавить 50 мл деионизированной воды и поместить магнитную мешалку. Надеть на колбу обратный холодильник, поставить колбу с содержимым на магнитную плитку и установить на плитке режим 375 об/мин и температуру 300^◦С;

4) через 6 мин (по отработанной в дипломной работе методике – время от момента постановки колбы с содержимым на плитку до начала стекания конденсата) внести 0,058 мл 10% раствора КЗ [1], кипятить 2 мин;

5) внести 0,72 мл 1% раствора 5,5-водного цитрата натрия;

6) при изменении цвета раствора с синего на красный изменить режим на магнитной плитке на 500 об/мин и снизить температуру до 200 ^◦С;

7) кипятить раствор еще 20 мин;

8) выключить магнитную плитку, снять обратный холодильник, остудить раствор при комнатной температуре и оставить до следующего дня с целью оценки на наличие осадка. Хранить в холодильнике при 4 ^оС.

С использованием описанной выше и отработанной по результатам данной работы методики для дальнейшего применения с целью разработки иммунохроматографической тест-системы для выявления H.pylori рекомендованы серии КЗ №10/1 и 12/1. Характеристика препаратов КЗ серий № 10/1 и 12/1 представлена в таблице 4.

Таблица 4 – Характеристики препаратов КЗ серий 10/1 и 12/1

Признак	КЗ №10/1	КЗ №12/1
Диаметр частиц коллоидного золота (dср) по данным электронной микроскопии, нм	26,7
Форма	Овальная, круглая	Овальная, круглая
Однородность	Однородные	Однородные
Наличие конгломератов	-	-
Результаты спектрофотометрии: оптическая плотность (ЕД), max пика поглощения;   длина волны max пика поглощения при измерении в диапазоне λ=200-600 нм	1,020   max при λ=526	0,867   max при λ=525
Диаметр частиц коллоидного золота (dср), определенный по результатам спектрофотометрии, нм [ ]		20-30

 

Для получения конъюгата с вышеуказанными сериями КЗ рекомендованы МкАт 387. Из данных, представленных в данной работе, следует, что «золотое число» (точка выхода графика на плато) для МкАТ 387 и серии КЗ № 10/1 соответствует 17 мкг·см^-3, для МкАТ 387 и серии КЗ № 12/1 соответствует 19 мкг·см^-3. С учетом данных литературы [87] рекомендуемая концентрация антител для конъюгации с сериями КЗ № 10/1 и 12/1 составляет, соответственно, 19,5 мкг·см^-3 и 23,0 мкг·см^-3.

 

Выводы по разделу

– Теоретически обоснована и экспериментально отработана методика приготовления наночастиц КЗ с диаметром 30 нм. Для приготовления 50 мл наночастиц КЗ с размером 30 нм в колбу Эрленмейера необходимо добавить 50 мл деионизированной воды, поместить в нее магнитную мешалку, надеть на колбу обратный холодильник, поставить колбу с содержимым на магнитную плитку и установить на плитке режим 375 об/мин и температуру 300^◦С. Через 6 мин от момента постановки колбы с содержимым на плитку внести 0,058 мл 10% раствора КЗ, кипятить 2 мин, после чего внести 0,72 мл 1% раствора 5,5-водного цитрата натрия. При изменении цвета раствора с синего на красный изменить режим на магнитной плитке на 500 об/мин и снизить температуру до 200 ^◦С. Кипятить раствор 20 мин. Через 20 мин выключить плитку, снять обратный холодильник, остудить раствор при комнатной температуре. Хранить в холодильнике при 4 ^оС;

– при отработке методики приготовления наночастиц КЗ с заданным размером экспериментально получено 12 серий препарата;

– с использованием метода электронной микроскопии и спектрофотометрии проведена оценка полученных серий КЗ и выбраны наиболее кондиционные по данному этапу исследования серии КЗ № 10, № 10/1, № 12, № 12/1 с размером частиц от 15 до 30 нм;

– с помощью постановки реакции по определению «золотого числа» проведена оценка адсорбционной способности четырех серий КЗ с выбранными для разработки иммунохроматографической тест-системы МкАт к Сag белку H.pylori – МкАт 1811 и МкАт 387;

– теоретически и экспериментально обоснован состав конъюгата коллоидного золота с антителами для разработки иммунохроматографической тест-системы, предназначенной для идентификации H.pylori: серии коллоидного золота 10/1 и 12/1 и МкАт к Сag белку H.pylori клон 387 с концентрацией, соответственно, 17 мкг·см^-3 и 19 мкг·см^-3.

 

Приложение А

(справочное)