ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Исследования проводили с генетически маркированным штаммом грамположительных бактерий Bacillus subtilis ВКПМ В-3157, продуцентом инозина, адаптированным к дейтерию рассевом до отдельных колоний на 2% агаре с ²Н₂О и последующей селекции по признаку устойчивости к ²Н₂О.

  В работе использовали ²Н₂О (99.9 ат.% ²Н), ²НСl (95.5 ат.% ²Н) и [U-²H]метанол (97.5 ат.% ²Н) (ЗАО Изотоп, Санкт-Петербург, РФ). Неорганические соли и D, L- глюкозу (Reanal, Венгрия) предварительно перекристаллизовывали в ²Н₂О, ²H₂O дистиллировали над перманганатом калия с последующим контролем изотопной чистоты ¹Н ЯМР-спектроскопией на приборе Brucker WM-250 (ФРГ) (Частота 70 МГц). Масс-спектры электронного удара ЭУ получены на приборе МB-80A (Hitachi, Япония) с двойным фокусированием (энергия ионизирующих электронов 70 эВ, ускоряющее напряжение 8 кВ, температура катодного источника 180-200⁰С) после модификации в метиловые эфиры N-диметиламинонафталин-5-сульфонильных производных аминокислот по разработанной раннее методике [7]. Масс-спектры FAB получены на импульсном масс-спектрометре VG-70 SEQ (Fisons, VG Analitical, США), снабженным цезиевым источником Cs⁺ на глицериновой матрице с ускоряющем напряжением 5 кВ и ионным током 0.6-0.8 мА. УФ-спектры регистрировали на программируемом спектрофотометре Beckman DU-6 (США) в диапазоне длин волн 220-280 нм. Центрифугирование осуществляли на центрифуге Т-24 (ФРГ) с охлаждением при -4⁰С. Аналитическую обращенно-фазовую ВЭЖХ проводили на жидкостном хроматографе Knauer (ФРГ), снабженным насосом Gilson (ФРГ) и рефрактометром Waters K-401 (ФРГ) на колонке Separon С18 (250 x 10 мм), элюция смесью ацетонитрил : вода, 75 : 25, об.%, скорость элюирования 0.6 мл/мин. Ионообменную хроматографию осуществляли на катионообменной колонке Biotronic LC-5001 (ФРГ) (230 x 3.2) с сульфированной стирольной (7.25% сшивки) смолой UR-30 (Beckman-Spinco, США); рабочее давление 50-60 атм; скорость подачи Na⁺-цитратного буфера 18.5; нингидрина 9.25 мл/ч; детекция при 570 нм. Уровень биоконверсии углеродного субстрата определяли, используя глюкозооксидазу (КФ 1.1.3.4) как описано в работе [35].

Биосинтетический ²Н-меченый инозин. Получен с выходом 3.9 г/л на синтетической тяжеловодородной среде (89-90% ат. ²Н), используя в качестве источника ²Н-меченых ростовых субстратов гидролизат биомассы метанол-ассимилирующего штамма факультативных метилотрофных бактерий Brevibacterium methylicum ВКПМ B-5662 (условия получения: автоклавирование в 0.1 н. ²НСl 30-40 мин при 08 ати), выделенный скринингом в условиях многостадийной адаптации на твердой среде М9 (2% агар) с 2% [U-²Н]метанолом со ступенчато увеличивающимся градиентом концентрации тяжелой воды (от 0 до 98% ²Н₂О). Состав синтетической тяжеловодородной среды (мас.%): глюкоза - 12; ²Н-меченый гидролизат B. methylicum - 2; NH₄NO₃ - 2; MgSO₄ ^. 7H₂O - 1; Са₂СО₃ - 2. Синтез проводили в колбах Эрленмейера вместимостью 500 мл (наполнение средой 100 мл) в течение 5-6 сут при 30-32⁰С в условиях интенсивной аэрации реакционной смеси на орбитальном шейкере S-380 (Венгрия).

Очистка ²Н-меченого инозина. Пробы КЖ центрифугировали при 2000 g, 10 мин, концентрировали при 10 мм рт. ст., добавляли ацетон при 0⁰С (3 x 5 мл). Смесь выдерживали 14-15 ч при -4⁰С, осадок отделяли центрифугированием при 1200 g, 5 мин. К супернатанту добавляли 10 г активированного угля, выдерживали 2 сут при 4⁰С. Водную фракцию отделяли фильтрованием, к твердой фазе добавляли 20 мл 50% этанола в 25% аммиаке (1 : 1, об.%), кипятили при 60⁰С с обратным водяным холодильником. Через 2-3 ч смесь фильтровали и упаривали при 10 мм рт. ст. Продукт экстрагировали 0.3 М NH₄-формиатным буфером (рН 8.9), промывали ацетоном (2 x 10 мл), сушили над безводным СaCl₂. Инозин перекристаллизовывали из 80% этанола, очищали методом ионообменной хроматографии на откалиброванной колонке Biorad (150 x 10 мм) с катионообменной смолой АG50WX 4 (Pharmacia, США), уравновешенной 0.3 М NH₄-формиатным буфером (рН 8.9) c 0.045 М NH₄Cl в условиях изократической элюции (хроматографическая чистота 92%). Контроль чистоты проводили методом ТСХ с использованием стандартного набора рибонуклеозидов фирмы Beckman-Spinco (США) на хроматографических пластинках (150 x 150 мм) с закрепленным слоем флуоресцентного носителя Silufol UV-254 (Чехословакия) в системе растворителей: H-бутанол : уксусная кислота : вода, 2 : 1 : 1, об.%. Выход 2.5 г/л (64%). Т. пл. 68-70⁰С. [a]_D²⁰ 1.61⁰ (с 1.5 этанол). R_f  0.5. рК_a 1.2 (фосфатный буфер, рН 6.87). УФ-спектр (0.1 н. НСl) (l_max 249 нм, e₂₄₉ 7100 М^-1 см^-1); FAB-спектр (глицериновая матрица Cs⁺, ускоряющее напряжение 5 кВ, ионный ток 0.6-0.8 мА): (M+H)⁺ m/z (I,%): 273, 20% (4 ат. ²Н); 274, 38% (5 ат. ²Н); 275, 28% (6 ат. ²Н); 276, 14% (7 ат. ²Н), (А + H)⁺ 136, 46%; (Б + Н)⁺ 138, 55%; (Б - НCN)⁺  111, 49%; (В - HCN)⁺ 84, 43%.  

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Young V.R., Yu Y.M., Krempf M. Protein and amino acid turnover using the stable isotopes ¹⁵N, ¹³C, and ²H as probes. in: New techniques in nutritional research // Whitehead R. G. (ed). Acad. Press. N. Y. 1990. V. 9. Р. 17-72.

2. Hruby V.J. // Synth. and Appl. Isot. Label. Compounds. 1985. V. 4. ¹1. Р. 287-292. 

3. Nelson J.E., Ruo T.I. // Clinica Chemica Acta. 1988. V. 175. ¹ 3. Р. 59-65.

4. Stockman B.J., Reily M.D., Westler W.M., Ulrich E.L., Markley J.L. // Biochemistry. 1989. V. 28. ¹ 7. Р. 230-236.

5. McIntosh L.P., Dahlquist F.W. // Quart. Rev. Biophys. 1990. V. 23. ¹ 1. Р. 1-38.

6. Argade P.V., Rothschild K.J., Kawamoto A.H., Herzfeld J., Herlihy W. C. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1981. V. 78. № 3. P. 1643-1646.

7. Мосин О.В., Складнев Д.А., Егорова Т.А., Швец В.И. // Биоорган. химия. 1996. Т. 22. ¹ 10-11. С. 856-869.

8. Darmaun D., Robert J. J., Bier D.M., Mathews D.E., Young V.R. // Annales-d’ Endocrinologie. 1985. V. 46. ¹ 4. Р. 355-356. 

9. Shvets V.I., Yurkevich A.M., Mosin O.V., Skladnev D.A. // Karadeniz Journal of Medical Sciences, 1995. V. 8. ¹ 4. P. 231.

10. Fesik S.W., Zuderweg E.R.P. // Quart. Rev. Biophys. 1990. V. 23. № 2. Р. 97-131.

11. Мосин О. В., Складнев Д. А., Егорова Т. А., Швец В. И. //Биотехнология. 1996. № 10. С. 24-40.

12. Пшеничникова А.Б., Карнаухова Е.Н., Звонкова Е.Н., Швец В.И. // Биоорган. химия. 1995. Т. 21. ¹ 3. С. 163-178.

13. Daub G. H. Syntheses with stable isotopes. in: Stable Isotopes, Proc. of the 3d Intern. Conference // Klein E. R. (ed). Academic Press. N. Y. 1979. Р. 3-10.

14. van der Berg E.M.M., van Liemt, Willem B.S // Recl. Trav. Chim. Pays-Bas. 1989. V. 108. ¹ 9. Р. 304-313.

15. Walker T. E., Matheny C. // J. Org. Chem. 1986. V. 51. Р. 1175-1179.

16. Фалеев Н.Г., Рувинов С. В., Сапоровская Н. В., Беликов В. М., Закомырдина Л.Н. // Изв. Ан. СССР. Сер. хим. 1989. Т. 10. Вып. 3. С. 2341-2343.

17. LeMaster D. // Quart. Rev. Biophys. 1990. V. 23. ¹ 2. Р. 133-174.

18. Mosin O.V., Skladnev D.A., Shvets V.I. // Bioscience, biotechnology, and biochemistry. V. 62. ¹ 2. P. 225-229.

19. Crespi H.L., Marmur J., Katz J.J. // Nature. 1962. V. 84. ¹ 1. Р. 3489-3491.

20. Crespy H.L. Stable Isotopes in the Life Sciences. International atomic energy agency Press. Vienna. 1977. Р. 111-121.

21. Daboll H.F., Crespi H.L., Katz J.J. // Biotechnol. Bioengineer. 1962. V. 4. ¹ 5. Р. 281-297.

22. Cox J., Kyli D., Radmer R. // Trends Biotechnol. 1988. V. 6. № 12. Р. 279-282.

23. Мосин О.В., Складнев Д.А., Швец В.И. // Изв. РАН. Сер. биол. ¹ 3. С. 1-10. 

24. Thomson J. F. Biological effects of deuterium. Pergamon Press. N. Y. 1963. P. 1-133.

25. Еремин В.А., Чекулаева Л.Н., Харатьян Е.Ф., Островский Д.Н. // Микробиология. 1978. Т. 32. Вып. 4. С. 629-636.

26. Busujima U.K., Shimiba S., Narita K., Okada S. // Chem. Pharm. Bull. 1988. V. 36. ¹ 4. P. 1828-1832.

27. Colby J, Dalton H. // Ann. Rev. Microbiol. 1979. V.33. ¹ 6. P.481-517.

28. Karnaukhova E.N., Reshetova O.S., Semenov S.Y., Skladnev D.A., Tsygankov Y.D. // Amino Acids. 1994. V.6. ¹ 2. P.165-176.

29. Skladnev D.A., Tsygankov Y.D. Convertion of stable isotope labeled methanol to components of bacterial biomass, in: 6 th Eur. Conf. of Biomass for Energy. Athens. Greece, 1991. P. 234.

30. Мосин О.В., Складнев Д.А., Егорова Т.А., Швец В.И. // Биотехнология. 1996. № 3. С. 3-12.

31. Складнев Д.А., Мосин О.В., Егорова Т.А., Еремин С.В., Швец В.И. // Биотехнология. 1996. № 5. С. 25-34.

32. Мосин О.В., Казаринова Л.А., Преображенская К.А., Складнев Д.А., Чеботаев Д.В., Юркевич А.М., Швец В.И. // Биотехнология. 1996 г. № 4. C. 19-27.

33. Мосин О.В., Карнаухова Е.Н., Пшеничникова А.Б.,Складнев Д.А., Акимова О.Л. // Биотехнология. 1993. № 9. С. 16-20.

34. Зорина А.В, Бабусенко Е.С. Химический состав биомассы метилотрофных бактерий. Современные проблемы биотехнологии микроорганизмов. // Тезисы докл. молодых ученых. Рига. 1987. Т. 1. № 2. С.35-40.

35. Полюдек-Фабини Р., Бейрих Т. Органический анализ. Руководство по анализу органических соединений. Л.: Химия, 1981. 514 c.

THE BIOSYNTHESIS OF ²H-LABLED INOSINE WITH HIGH LEVEL OF DEUTERIUM ENRICHMENT

О . V. MOSIN

М oscow State Academy of Fine Chemical Technology named after М .V. Lomonosov, 117571 Moscow, Vernadskogo Pr., 86;

       The biosynthesis of ² Н -labeled purine ribonucleoside inosine (yeald 3/9 g/l) with using an adapted to deuterium strain of Bacillus subtilis on heavy water medium with highly level of deuteration (89-90 at.% ²H₂O), containing 2% hydrolyzate of biomass of methylotrophic bacterium Brevibacterium methylicum as a source of ²H-labeled growth substrates (the biosynthetic conditions: synthetic medim M9 with 98% ² Н ₂ O and 2% [U-² Н ]methanol, the incubation period 5-6 days at 37⁰C) was carried out. The studyng of the level of deuterium enrichment of inosine by a method of FAB mass-spectrometry found out the polymorhysm of isotopic introduction into the molecule (isotopic composition of inosine: 4 at. ²H, 20%, 5 at. ²H, 38%, 6 at. ²H, 28%, 7 at. ²H, 14%) with deuterium introduction to ribose and hypoxantine fragments of the molecule.