Лигнолитический ферментный комплекс дереворазрушающих

Грибов

Способность грибов разрушать лигниновый компонент древесины известна давно. Наиболее активными деструкторами лигнина в природе являются грибы белой гнили, которые образуют гетерогенную группу, состоящую большей частью из базидиомицетов, относящихся к семействам Agaricaceae, Corticaceae, Pleurotaceae, Strophariaceae и нескольких аскомицетов [6]. Так как в качестве лигнинолитиков изучены преимущественно базидиомицеты, то в узком смысле под грибами белой гнили обычно понимают лигнинолитические базидиомицеты. Наиболее подробно изучены Phanerochaete chrysosporium, Coriolus versicolor и Pleurotus ostreatus. [4]

Хотя лигнин является потенциально богатым энергией материалом, он не может служить единственным источником углерода и энергии, его деградация возможна при наличии в среде ростового субстрата, такого как целлюлоза или глюкоза. Деградация лигнина является событием вторичного метаболизма и происходит когда в среде культивирования исчерпываются источники углерода, азота или серы. [14] Разложение лигнина – процесс окислительный, стимулирующее действие кислорода на биодеградацию лигнинового полимера характерно для всех грибов белой гнили. Лигнинолитический процесс у этих грибов подвержен влиянию рН, максимум лигнинолитической активности приходится на рН 4,5 [13].

Структура высокомолекулярной полимерной гидрофобной молекулы лигнина определяет свойства расщепляющей его ферментативной системы. Такая система должна быть внеклеточной негидролитической и неспецифической. Лигнинолитическая система грибов белой гнили является внеклеточной окислительной и неспецифической, и включает лигнин пероксидазу, Mn-пероксидазу и лакказу [4].

Лигнин – глобулярный нестереорегулярный нерастворимый полимер. Его молекулярная масса более 10 000. Состоит из остатков фенилпропана, соединенных несколькими типами углерод – углеродных и эфирных связей. Молекулы этого ароматического вещества при образовании лигнина соединяются друг с другом случайным образом с помощью разных химических связей не подающиеся химическому расщеплению. У растений лигнин образует комплекс с гемицеллюлозой, в которой заключены проводящие пучки. Лигнин обусловливает ригидность растений, а также их устойчивость к механическим повреждениям и действию микробов [1].

С развитием биотехнологии базидиомицеты становятся доступным источником ферментов различных классов. Способность базидиомицетов синтезировать внеклеточные ферменты, характеризующиеся высокой активностью и стабильностью, дает возможность использовать их ферментные комплексы для практических целей [14].

В настоящее время во всем мире ведется интенсивная разработка технологий на основе базидиальных лигнинолитических грибов и их ферментов как для обработки лигниноцеллюлозных материалов, так и для утилизации лигнинсодержащих отходов, накапливающихся в природе в огромных количествах [15].

Дереворазрушающие базидиомицеты отличаются высоким содержанием окислительно-восстановительных ферментов, в первую очередь пероксидазы, Мп-пероксидазы, тирозиназы и лакказы [8]. Высшие базидиомицеты по составу лигнолитических ферментов объединяют в следующие группы:

В первую группу вошли грибы, обладающие лакказой, лигнин- и марганецпераксидазой активностью Phellinus ріпі, Trametes hirsuta, Bjerkandera adusta, Phanerochaete chrysosporium.

Вторая группа представлена грибами Lentinu s edodes, Pa n us tigrinus, P. chrysosporium, Dichomitus squalens, обладающих Mn-пероксидазной и лакказной активностью.

Третья группа характеризуется лигнинпероксидазной и лакказной активностью – грибы Trametes versicolor, Phlebia radiate, Pleurotus ostreatus.

Грибы, составляющие четвертую группу определены как Pleurotus ostreatus, P. eringii, В. adusta и для них характерна лакказа, арилалкогольоксидаза и другие ароматические оксидазы [12].

Разнообразное сочетание ферментативных комплексов у лигнинразрушающих грибов связано в первую очередь с экологическими особенностями грибов, трофической специализацией и является следствием длительной эволюции растений и грибов [7]. Представители различных таксономических и экологических групп обладают сходным составом ферментов. Однако уровень активности внеклеточных ферментов имеет существенную штаммовую и видовую вариабельность [10].

Внеклеточные лигнинолитические ферментные комплексы грибов белой гнили включают следующие типы окислительно-восстановительных ферментов: I. гем-содержащие ферменты, П. флавинсодержащие ферменты, III. целлобиозодегидрогеназа, IV. медьсодержащие ферменты [4].

Помимо лигнинразрушающих ферментов эти грибы образуют также системы гидролаз, гемицеллюлозы и целлюлозу [9].

I. Гемсодержащие ферменты,среди которых принято особо выделять лигнинпероксидазы (LiP) и марганец-пероксидазы (МnР). Основная функция этих ферментов – прямое, как у LiP или опосредованное медиатором (вератролом у LiP и ионами Мn у МnР) одноэлектронное окисление ароматических субстратов до соответствующих радикалов и двухэлектронное восстановление перекиси водорода до воды [4].

Лигнинпероксидаза(диарилпропаноксигеназа, Н₂0₂-зависимая оксигеназа, лигниназа, КФ 1.11.1.14) – гемсодержащий фермент с молекулярной массой 39-42 кДа, являющийся донором Н₂0₂. Катализирует различные реакции одноэлектронного окисления ароматических соединений (предпочтительно нефенольных) за счет кислорода перекиси водорода, с восстановлением ее до воды. К ним относят:

1. Сα−Сβ – разрыв пропильной группы лигнина и модельных соединений.

2. Гидроксилирование бензильных метиленовых групп.

3. Окисление бензиловых спиртов до соответствующих альдегидов и кетонов.

4. Окисление фенолов и расщепление ароматического кольца в нефенольных модельных соединениях лигнина [16, 17].

Полученный арильный катион-радикал спонтанно разрушает различные связи в зависимости от структуры и наличия реактанов. Лигнинпероксидаза способна окислять и фенольные соединения. При этом образуются в результате окисления ферментов нефенольных соединений. Выделено около 15 изоформ данного фермента [16]. Лигнинпероксидаза обнаружена лишь у немногих базидиальных грибов: Phanerochaete chrysosporium, Trametes versicolor, Trametes hirsuta, Panus tigrinus, Coriolopsis occidentalis [13].

Мn-зависимая пероксидаза – гемсодержащий фермент (КФ 1.11.1.3), участвующий в деполяризации синтетического лигнина [16]. Она окисляет фенольные соединения в присутствии перекиси водорода. Проявляет активность в среде, содержащей Мn, имеет молекулярную массу 46 кДа [8]. Впервые выделена из культуральной жидкости гриба Ph . chrysosporium. Принцип функционирования фермента заключается в окисление Мn²⁺ до Мn³⁺ с использованием пероксида водорода в качестве окислителя. Активность фермента стимулируется простыми органическими кислотами, которые стабилизируют ион Мn³⁺. В результате взаимодействия последнего с кислотами образуется хелат, обладающий окислительными свойствами [16]. Регенерация Мn осуществляется сопряженной реакцией разложения перекиси водорода. При отсутствии в среде Н₂0₂ Мn-зависимая пероксидаза способна продуцировать пероксид водорода. Мn-зависимая пероксидаза отмечена у таких грибов как Trametes versicolor, Phlebia radiate, Dischomitus squalens и др. [13].

П. Флавинсодержащие ферменты,осуществляющие, в основном двухэлектронное восстановление молекулы кислорода до перекиси водорода и одновременно двухэлектронное окисление ОН-группы, соответствующих субстратов, до карбонильных групп. Среди них – глюкозооксидазы, пиранозо-2-оксидазы, метанол-оксидазы, арилалкогольоксидазы [13].

Глюкозооксидаза – флавинсодержащая оксидаза с молекулярной массой 80 кДа, катализирующая окисление глюкозы, восстанавливая при этом кислород до перекиси водорода. Глюкозооксидаза выявлена у грибов Pa n us tigrinus, P. Chrysosporium [8].

Пираноза-2-оксидаза ароматических спиртов, катализирует окисление низших первичных и ароматических спиртов до соответствующих альдегидов и пероксида водорода [13].

Арилалкогольоксидаза(вератрил-алкоголь оксидаза), внеклеточная флавин-оксидаза с молекулярной массой 72,5-78 кДа, катализирует окисление ароматических спиртов до альдегидов, восстанавливая кислород до перекиси водорода. Арилалкогольоксидаза отмечена у грибов, вызывающих белую гниль древесины: Phanerochaete chrysosporium, Trametes versicolor [13].

Метанолоксидаза(МеО), внеклеточный флавин-содержащий фермент с молекулярной массой 75 кДа, катализирует окисление метанола, выделяющийся при деградации лигнина в реакциях деметилирования фенолов, до формальдегида, восстанавливая кислород до перекиси водорода. Выделена и охарактеризована у Phanerochaete chrysosporium , Trametes versicolor , Panus tigrinus [13].

III. Медьсодержащие ферменты. Разделяют на две группы.

III.1 Голубые оксидазы – лакказа и родственные или им неголубые оксидаза, осуществляющие четырехэлектронное восстановление кислорода до воды с параллельным одно- или двухэлектронным окислением преимущественно фенольным субстратом до соответсвующих феноксирадикалов или хинонов. [8]

Катехолоксидазаучаствует в гидроксилировании монофенолов до дифенолов и окислении дифенолов в ортохиноны. Она широко распространена среди микроорганизмов и имеет названия, соответствующие катализируемому субстрату: монофенолоксидаза, полифенолоксидаза, фенолаза, крезолаза, тирозиназа и т. п. [13].

Лакказы (бензидол: кислород оксидоредуктаза, КФ 1.10.3.2) – голубая медьсодержащая оксидаза, которая катализирует четырехэлектронное окисление фенолов, ароматических аминов и фенилендиамина, используя кислород как акцептор электронов с восстановлением его до воды. Практически все исследованные лакказы – это мономеры, гликопротеины с углеводной частью от 1 до 15% массы фермента, которая состоит из остатков маннозы и N-ацетилглюкозамина [16]. Окисляют широкий круг субстратов преимущественно фенольной природы с образованием феноксильных радикалов, а также нефенольные соединения в присутствии специфических электронных переносчиков ABTS или HBT (1-гидроксибензотриазол) [16]. Лакказы древоразрушающих грибов имеют более низким Ph-оптимумом окисления фенольных субстратов, совпадающим с оптимум действия большинства грибных целлюлаз. Так, для лакказ Gaeumannomyces graminis var . tritici, древоразрушающего базидиомицета PM1, Coriolus histris он близок к 4,5Ph, для лакказ других трутовиков (C . zonatus , Tramenas sanguinea, Polyporus pinsitus) составляет 4,9 Ph -5Ph [4].

III.2 Медьсодержащие ферменты, осуществляющие двухэлектронное восстановление кислорода до перекиси с одновременным двухэлектроным окислением подходящей спиртовой или альдегидной группы (глиоксальоксидаза, галактооксидаза) [8].

Наибольшей оксидазной активность обладают штамма Trametes hirsute D-5 и Gerrena unicolor М-2 [18].

Лигнин под действием бурых гнилей преимущественно гидроксилируется и деметилируется и в меньшей степени депомилиризуется. Окисление непосредственно идет до углекислоты с изъятием углерода в основном из боковых цепей и метоксильных групп [13].

Предположительно, лигнинразрущающие ферменты действуют на поверхности гиф, находящихся в контакте с клеточной стенкой. Вместе с тем, разложение наблюдается не только в местах контакта, но и по всей поверхности люмена, если там находятся всего одна-две гифы гриба, и даже в толще вторичной оболочки. Снижение выхода низкомолекулярных продуктов окисления лигнина (ароматических кислот и альдегидов) после обработки древесины лигнинразрушающими грибами объясняет их окислительным и конденсирующим действием. Однако разные грибы в разной степени окисляют и конденсируют остаточный лигнин [4].

Так было показано, что выявленная на поверхности мицелия внеклеточная лакказа штамма гриба Pleurotus ostreatus Dl могут участвовать в начальных этапах метаболизма полициклических ароматических углеводородов (в данной работе хризена). Тогда как гибридная Mn-пероксидаза окисляла образующиеся метаболиты (фталевая кислота) [12].