Аналитические принципы

Курсовая работа

По фармацевтической химии

Тема: Современное состояние и перспективы применения рецепторных методов для определения лекарственных веществ и их метаболитов

Введение

К концу 50-х - началу 60-х гг. XX в. было обращено внимание на зависимость фармакологической активности от таких физических факторов, как степень измельчения и явление полиморфизма, а также от технологических процессов получения ЛС. Возникло своеобразное противоречие между существовавшими нормами оценки качества и фактическим действием ЛС. Последние по результатам аналитического контроля соответствовали в одинаковой степени требованиям фармакопеи (ФС), но различались по фармакологическому эффекту. Так возникло понятие о терапевтической неэквивалентности ЛС. Оно означает, что одни и те же ЛФ, содержащие одинаковые количества ЛС, но изготовленные разными способами, оказывают неодинаковый терапевтический эффект. Установить причину такого явления можно только проведением биофармацевтических и фармакокинетических исследований.

Сформулированные к настоящему времени основные принципы установления количественных соотношений между химической структурой и фармакологической активностью можно представить в виде трех основных стадий. Первая (биофармацевтическая) включает исследование исходного биологически активного вещества и создание на его основе готовой лекарственной формы. Вторая стадия (фармакокинетическая) включает исследование таких происходящих в организме кинетических процессов, как всасывание, распределение, связывание с белками, биотрансформация и выведение (экскреция) ЛС. Эти процессы изучаются в сопоставлении с фармакологическим или токсическим действием этих веществ на организм. Третья стадия (фармакодинамическая) включает исследование взаимодействия ЛС с рецептором и влияние на регуляторные системы. Следовательно, биологическая активность ЛС объясняется последовательно происходящими тремя фазами: биофармацевтической, фармакокинетической и фармакодинамической.

Проведение фармакокинетических испытаний осуществляется на стыке нескольких наук и требует участия различных специалистов: врача-клинициста, врача-лаборанта, биохимика, провизора-аналитика, микробиолога, а в ряде более сложных случаев также биофизика, математика, программиста.

Исследования в области фармакокинетики проводятся на животных в период доклинических испытаний, во время клинических испытаний, при разработке технологии производства и контроля качества ЛФ, а также продолжаются после внедрения ЛС в медицинскую практику.

Проведение фармакокинетических исследований возможно только на основе применения современных методов биофармацевтического анализа, позволяющих проследить процесс всасывания и распределения ЛС в органах и тканях.

Они включают выяснение влияния различных биофармацевтических факторов на терапевтическую эффективность ЛС; изучение их биологической доступности и разработку методов ее определения; создание способов определения ЛС и их метаболитов в биологических жидкостях [6].

Эти данные дают возможность ориентироваться в понимании механизма действия, прогнозирования химической структуры ЛС, обусловливающей направленное действие.

Иначе говоря, результаты фармакокинетических исследований существенно дополняют данные о связи между химической структурой и фармакологической активностью ЛС.

Биофармацевтические и фармакокинетические исследования позволяют решить ряд практических задач, например, дать рекомендации по изменению физических или химических свойств ЛС для повышения их фармакологической активности; обосновать оптимальный выбор биофармацевтических факторов при производстве тех или иных ЛФ.

Практическое значение имеют и такие рекомендации, как уточнение показаний и противопоказаний, установление рациональных терапевтических доз и периодичности их приема в течение суток, определение оптимальных путей введения ЛС в организм, разработка научно обоснованных схем лечения тех или иных заболеваний.

Определение

Рецепторное взаимодействие используется в методике, в которой меченый компонент, лиганд, который связывается с рецептором, используется, чтобы обнаружить этот рецептор. Обычно лиганды помечают радиоактивными изотопами, такими как 3H, 125I, 35S и т.д., но мечение флуоресцирующими фрагментами также возможно. Рецептор может быть расположен в гомогенизированной или нативной ткани или может быть воспроизведен с помощью рецепторного гена. Препараты ткани инкубируют с меченым лигандом, который имеет высокий аффинитет к целевому рецептору. Меченый лиганд, связавшийся с тканью, затем собирают и определяют, используя различные методики, такие как фильтрующие методики в сочетании с подсчетом радиоактивности, сцинтилляционным подсчетом и ауторадиографией для радиоактивных лигандов, или время-зависимый флуоресцентный резонансный энергетический перенос (TR-FRET) или усиленный флуориметрический гомогенный анализ (AlphaScreen) для лигандов, меченых флуоресцирующими или хемилюминесцирующими молекулами. Эти методики применяются in vitro или ex vivo. In vivo рецепторное связывание может быть исследовано с использованием позитронной эмиссионной томографии или монофотонной эмиссионной компьютерной томографии (SPECT).

Впервые рецептор-связывающие методики анализа были предложены в 1970х (исторический взгляд: Lefkowitz 2004; Snyder and Pasternak 2003). В более ранние года не было никакой информации о природе или структуре рецепторов. Обширные исследования на протяжении 1980х, ведущие к синтезу рецпепторных генов и идентификации их структуры. На сегодняшний день, открыты и исследованы три больших класса рецепторов, локализованные на клеточной мембране и один класс цитозольных рецепторов.

. G-белок-ассоциированные рецепторы (GPCRs), также называемые 7-трансмембранные рецепторы, интегральные мембранные белки-мономеры. Выделено и изучено 802 человеческих G-белка, это самая большая группа рецепторов и по меньшей мере 50 из них являются мишенями действия лекарственных средств.

. Мультимерные лиганд-ассоциированные ионные каналы, чаще всего представляющие собой пентамеры, образующие поры в мембране. Пример рецепторов этой группы - N-холинорецепторы, GABAA , 5-HT3, глициновые рецепторы, NMDA и др.

. Рецепторы, являющиеся ферментами с лиганд-связанным доменом, которые работают в связи с ферментом на внутренней стороне мембраны, такие как гуанилатциклаза, тирозинкиназа, тирозинфосфатаза, серин/треонинкиназа. Рецепторами этого семейства являются также клеточный фактор роста, трансформирующий фактор роста, нейротропный рецепторный фактор.

. Цитозольные рецепторы, регулирующие транскрипцию в клеточном ядре. Члены этого семейства - стероидные, ретиноидные и тиреоидные рецепторы.

Большое число членов каждого из этих рецепторных семейств изучались как нейромедиаторы с помощью анализа рецепторного связывания и рецепторных методов, описаны сотни различных молекулярных мишеней для них [4].

Принцип метода

Рецепторный метод анализа основан на конкурентном ингибировании анализируемым соединением связывания меченого лиганда со специфическими к нему мембранными рецепторами. Следствием применения мембранных препаратов рецепторов являются: 1) высокая чувствительность рецепторного метода, связанная с высоким сродством рецепторов к своим лигандам; 2) высокая его специфичность, обусловленная самой природой рецепторов; 3) доступность мембранных препаратов, содержащих рецепторы: исходным материалом для мембран обычно служит мозг животных; 4) относительная простота разделения свободного и связанного с мембранами меченого лиганда: являясь достаточно крупными частицами мембраны со связанной с ними меткой, легко отделяются от меченого лиганда в растворе путем вакуумного фильтрования или центрифугирования; 5) возможность дискриминации типа лиганда: выше было показано, что, например, опиоидные рецепторы гетерогенны, поэтому, используя в анализе меченые лиганды той или иной селективности, можно определить, к какому типу лигандов следует отнести данное тестируемое соединение; 6) возможность определения агонист-антагонистической природы лиганда; являясь частью биохимической системы передачи сигнала, рецепторы в различных средах по-разному взаимодействуют с агонистами и антагонистами: например, для агонистов опиоидных рецепторов известен так называемый натриевый сдвиг - сильное, более чем на порядок, ухудшение IC50 при добавлении солей натрия, в то время как на сродство антагонистов натриевая среда не влияет: влияние ионов натрия на связывании агонист-антагонистов существенно менее выражено [4].

Аналитические принципы

Анализ рецепторного связывания производится в соответствии с аналитическими принципами и методами. Используется дважды дистиллированная вода, химические реагенты качества ч.д.а. Меченые лиганды должны иметь чистоту не менее 98%, чистота должна регулярно контролироваться (например, радиолиганды подвергаются радиоактивному распаду). Стабильность соединений должна проверятся по мере необходимости (например, катехоламины и индоламины крайне нестабильны и раствор их приготавливается непосредственно перед применением). Аналитические весы, пипетки также должны быть откалиброваны. Соединения должны быть растворены в жидкостях, соответственно их физико-химическим свойствам. Следует избегать применения пластиковых пробирок и деталей в автоматических аналитических устройствах, чтобы избежать адсорбции и потерь липофильных компонентов.

Лиганд-рецепторное взаимодействие происходит согласно закону действующих масс. Требуется также тщательно контролировать температуру процесса.

При проведении рецепторного анализа искомой может быть изотерма концентрации меченого лиганда, кинетика связывания лиганда с рецептором, конкурентное связывание - в зависимости от этого выделяют и различные типы анализа [4].