Методика и ход работы

Материалы и оборудование – те же, что в задаче 1.

Ход работы.

Приготовить препарат диафрагмы с нервом и хорошо растянуть его в камерке. Для регистрации ПКП необходимо перед началом опыта убедиться, что проведение по нерву не нарушено. Для этого на раздражающие электроды, расположенные в камерке, нужно поместить нерв и проверить сокращается ли мышца при раздражении нерва. Примерные параметры раздражения нерва на ЭСЛ-2 в условиях, когда раздражающие электроды находятся в растворе Лайли, следующие: частота раздражения – 0,5 имп/с; длительность стимула – 0,1-0,5мс; сила раздражения (сверхпороговая) – 1-1,5В.

Регистрацию ПКП проводят при отсутствии потенциалов действия и сокращений мышцы, для этого используют частичную блокаду мышечных холинорецепторов, частичный магниевый блок кальциевых каналов терминалей или - т.н. рассеченный нервно-мышечный препарат.

Приготовление рассеченного нервно-мышечного препарата. После проверки наличия проведения сигнала (ПД) по нерву и ответного сокращения мышцы подготовить препарат для рассечения мышечных волокон диафрагмы. Для этого на расстоянии примерно 2 мм от места прикрепления мышечных волокон к ребрам с одной стороны и 2 мм от начала прикрепления мышечных волокон к центральному сухожилию с другой стороны, в мышцу втыкают два параллельных ряда тонких и коротких (3-4 мм) энтомологических булавок. Расстояние между рядами булавок должно быть не больше 2-3 мм, чтобы они могли поддерживать натяжение мышечного препарата. После этого под бинокуляром скальпелем проводим рассечение мышечных волокон между двумя рядами булавок с обоих сторон, при этом примерно 1/3 мышечных волокон на одном краю нервно-мышечного препарата оставляем не рассеченной, для визуального контроля за состоянием нерва. Далее необходимо 40 минут отмывать препарат в большом объеме физиологического раствора Лайли. Проверить качество рассечения – на рассеченных участках мышцы не должно наблюдаться сокращение при стимуляции нерва. После этого ввести микроэлектрод в мышечное волокно. О попадании в синаптическую зону можно судить по появлению минПКП. Далее включить стимуляцию, если видны ПКП, настроить усиление на постусилителе, чтобы ПКП целиком отображались на экране. Регистрация проводится также, как и в Задаче 1.

Рис. 8. Вид ПКП зарегистрированных при отведении потенциалов от рассеченного препарата. Показаны наложенные друг на друга два последовательновызванных ПКП

Использование «рассеченного» препарата позволяет проводить одновременную регистрацию МПКП и ПКП в одном синапсе. Для регистрации одиночных ПКП проводят стимуляцию диафрагмального нерва сверхпороговыми импульсами длительностью 0,1 мс с частотой 0,3 Гц (необходимо зарегистрировать 50 ПКП). При изучении ритмической активности синапса стимулируют нерв короткими пачками импульсов (50 стимулов, с частотой 4-50 Гц – диапазон частот задается преподавателем). При такой схеме эксперимента МПКП в синапсе записываются заранее, до включения стимулятора в режим генерации короткой пачки импульсов. Интервал между регистрациями ритмической активности в одном синапсе (нанесения на нерв короткой пачки стимулов) должен составлять 1-3 минуты (в это время можно сменить раствор в экспериментальной камере).

После регистрации ПКП в нормальном растворе Лайли произвести регистрацию ПКП на фоне действия исследуемого вещества (например ингибитора ацетилхолинэстеразы или другого, предложенного преподавателем).

Обработка результатов

Конвертирование файлов и обработка данных в программе MiniAnalysis проводятся так же, как в задаче 1. Необходимо проанализировать не менее 50 ПКП и 100 МПКП в каждом зарегистрированном синапсе. Поскольку временной ход МПКП и ПКП различен, каждая запись анализируется 2 раза – для МПКП и ПКП (изменяют параметры Period to search a local maximum (us) и Time before a peak for baseline (us)), каждую таблицу (МПКП или ПКП) необходимо сохранять в отдельный файл формата *.evt. Рассчитывают среднюю амплитуду и времена нарастания и полуспада ПКП и МПКП в каждом синапсе, и во всей обследованной выборке синапсов.

Квантовый состав ПКП рассчитывают по следующей схеме:

1.Сначала амплитуды МПКП и ПКП стандартизируются к мембранному потенциалу -50 мВ для коррекции изменения движущей силы МП

А_станд=A∙(-50 мВ/зарегистрированный МП)

2.Затем проводят коррекцию нелинейной суммации амплитуды для ПКП по формуле:

A_корр=A_станд/([1-0,8*A_станд]/E),

где А_корр – скорректированная в отношении нелинейной суммации амплитуда ПКП, А_станд – некорректированная амплитуда ПКП (но стандартизированная к МП=-50 мВ !!!), Е – зарегистрированный МП.

3.Далее считаем квантовый состав мПКП

КС = А_корр(ПКП)/ А_станд(МПКП).

При анализе коротких залпов ПКП, состоящих из 50 сигналов могут выявляться следующие характерные изменения амплитуды ПКП по ходу залпа: кратковременный прирост амплитуды ПКП в начале залпа (т.н. начальное облегчение нервно-мышечной передачи), снижение амплитуды ПКП (депрессия нервно-мышечной передачи) до стабильного, но сниженного по сравнению с первым ПКП в залпе уровня. Эту фазу принято называть фазой «плато» ПКП в залпе. Рассчитывают выраженность (в %) начального облегчения (если оно присутствует), депрессии и уровень «плато» (за 100% принимают амплитуду или квантовый состав первого ПКП в залпе).

Все значения исследуемых характеристик МПКП и ПКП представляются в виде среднее ± стандартная ошибка среднего (она считается как стандартное отклонение, деленное на корень из числа событий).

Необходимо сравнить амплитудно-временные характеристики МПКП и ПКП и квантовый состав ПКП до и после действия исследованного вещества (ингибиторов АХЭ или др.)

Литература

Чайлахян Л.М., Балезина О.П.. «Электрофизиология возбудимых систем. Потенциал покоя.», изд-во «Джангар», Элиста, 2009.

Учебник "Физиология человека" в 3-х томах под ред.Р.Шмидта и Г.Тевса, т.1, главы " Потенциал покоя”.”Потенциал действия", 1996.

Николс Дж.Г., А.Р.Мартин, Б.Валлас, П.Фукс. "От нейрона - к мозгу", главы 5,6. Изд-во “Мир”, М.,2003.

Зефиров А.Л. Мембранный потенциал покоя и потенциал действия. В сб. «Современный курс классической физиологии» п/р Ю. Наточина и В.Ткачука, стр.5-58. Изд-во Геотар-Медиа, М..2007

Катц Б. Нерв, мышца и синапс. М., 1969.

Куффлер С. и Николс Дж. От нейрона к мозгу. М., 1979. С.171-184.

Эккерт С., Рендел Д., Огастин Дх. Физиология животных. М., 1992. T.I, С. 164-214.

Контрольные вопросы

· Что означает нормальное (гауссово) распределение амплитуд миниатюрных ПКП в нервно-мышечном синапсе диафрагмы мыши?

· Если в конкретном опыте было получено аномальное распределение амплитуд минПКП (асимметричное), скошенное в сторону низкоамплитудных значений, о чем это говорит?

· Предложите объяснение, чем может быть обусловлено асимметричное и скошенное в сторону низкоамплитудных значений распределение минПСП у нейрона?

· Если при действии на нервно-мышечный препарат исследуемого нового вещества Х было обнаружено, что возрастает амплитуда минПКП, а амплитуда ПКП остается неизменной по сравнению с контролем, то каковы точки приложения и способы действия вещества Х в синапсе? Если при действии вещества Х амплитуда минПКП не изменилась по сравнению с контролем, а амплитуда ПКП возросла, то каков характер действия вещества X?

· Перечислите свойства синапса (функциональные, структурные), влияющие на временной ход минПКП (на время нарастания и время полуспада).

· Сравните природу генерации ПД и ПКП и их параметры.

· Что такое квантовый состав ПКП и каковы способы его подсчета?

· Существуют ли принципиальные различия в характере гистограмм амплитудных распределений минПКП и вызванных ПКП? Какие это различия?

· Что такое равновесный потенциал для ПКП? Как он вычисляется?