Постановка реакции для определения «золотого числа»
Обязательным этапом конструирования иммунохротографических тест-систем является определение «золотого числа», т.е. минимального защитного количества гидрофильного полимера, способного адсорбироваться на поверхности 10 мл золя золота и предотвращать его коагуляцию при добавлении к нему 1 мл 10% раствора NaCl. Оценка адсорбционной способности также может характеризовать кондиционность, приготовленных наночастиц коллоидного золота [1]. При постановке реакции использовали серии КЗ № 10, 10/1, 12, 12/1 и МкАт 1811 и 387 («Биалекса», Россия) с концентрацией белка 4,5 мг×см-3 и 8,0 мг×см-3 соответственно. Разведения антител и постановку реакции проводили в 96-луночных круглодонных полистероловых планшетах на наиболее часто используемом для этих целей, по данным литературы, 0,005 М карбанатно-бикарбонатном буфере [….]. 0,005 М карбанатно-бикарбонатный буфер (КББ) готовили из 0,2 М КББ с рН 9,0-9,5 ЕД. Приготовление 0,2 М КББ с рН 9,0-9,5 ЕД: · 1 М (К2CO3) = 138,2 г на 1 л – 1 М раствор; 27,64 г на 1 л – 0,2 М раствор; 2,764 г на 100 мл – 0,2 М раствор; · 1 М (NaHCO3) = 84 г на 1 л – 1 М раствор; 16,8 г на 1 л – 0,2 М раствор; 1,68 г на 100 мл – 0,2 М раствор; 0,168 г на 10 мл – 0,2 М раствор. Путем добавления к 0,2 М раствору NaHCO3 0,2 М раствора К2CO3 получали раствор карбонатно-бикарбонатного буфера с рН 9,5 ЕД. Из 0,2 М КББ готовили 5 мМ раствор КББ путем разведения 0,2 М раствора КББ в 40 раз: 1 часть 0,2 М КББ (250 мкл) + 39 частей деионизированной воды (9750 мкл). Все растворы для постановки реакции для определения «золотого числа» фильтровали через шприц-насадку с размером пор 0,22 µ. Разведение МкАт (1811 и 387) для постановки реакции. МкАт 1811 с исходной концентрацией 4,5 мг×см-3 разводили на 0,005 М КББ до 200 мкг×см-3. Для приготовления 800 мкл антител с концентрацией 200 мг×см-3, предназначенных для тестирования, 35,55 мкл антител с исходной концентрацией 4,5 мг·см-3 добавляли к 764,45 мкл 0,2 М карбонатно-бикарбонатного буфера с pH 9,0 ЕД. МкАт 387 с исходной концентрацией 8,0 мг×см-3 разводили на 0,005 М КББ до 200 мкг×см-3. Для приготовления 250 мкл антител с концентрацией 200 мкг×см-3, предназначенных для тестирования, 6,25 мкл антител с исходной концентрацией 8 мг·см-3 добавляли к 243,75 мкл 0,2 М карбонатно-бикарбонатного буфера с pH 9,0 ЕД. Постановка реакции. Для постановки реакции с целью определения золотого числа (ЗЧ) использовали два планшета: планшет № 1 – определение ЗЧ для МкАт 1811, планшет № 2 – определение ЗЧ для МкАт 387. Реакцию с каждой серией КЗ ставили в 2 повторностях. Ниже представлен алгоритм постановки реакции с МкАт 1811 и сериями КЗ № 10, 10/1, 12, 12/1 в планшете № 1: 1. Все серии КЗ доводили 0,2 М К2CO3 до рН 9,5 ЕД. 2. Во все лунки восьми горизонтальных рядов 96-луночного круглодонного пиолистеролового планшета вносили по 100 мкл 0,005 М карбонатно-бикарбонатного буфера с pH 9,5 ЕД; 3. В первые лунки планшета (А1-Н1) вносили по 100 мкл раствора МкАт 1811 с концентрацией 200 мкг·см-3, при этом конечная концентрация антител в лунках А1-Н1 при добавлении их к 100 мкл буфера составила 4. Далее титровали содержимое лунок А1-Н1 слева направо с шагом два путем переноса 100 мкл раствора МкАт из каждой предыдущей лунки в каждую последующую. Таким образом, концентрация МкАт составила в лунке А1 – 100 мкг·см-3, в А2 – 50 мкг·см-3, в А3 – 25 мкг·см-3, в А4 – 12,5 мкг·см-3, в А5 – 6,25 мкг·см-3, в А6 – 3,125 мкг·см-3, в А7 – 5. В каждую лунку двух горизонтальных рядов (в 2-х повторностях) вносили по 100 мкл КЗ, не задевая носиком содержимое лунок: в лунки рядов А-В – КЗ №10, С-D – №10/1; E-F – 12; G-H – №12/1; 6. Содержимое лунок инкубировали 15 мин; 7. По окончанию инкубации в каждую лунку вносили по 22 мкл 10%-ного раствора натрия хлорида. Конечная концентрация NaCl в каждой лунке при этом составила 1%; 8. Содержимое лунок перемешивали справа налево; 9. Инкубировали 10 мин. Аналогичным образом проводили постановку реакции в планшете № 2 с МкАт 387. Результаты постановки реакции определяли визуально и на спектрофотометре. При визуальной оценке за «золотое число» принимали концентрацию антител в лунке, имеющей стабильную розовую окраску (где отсутствовало изменение цвета с розового на голубой-синий). Результаты визуальной оценки реакции определения ЗЧ для МкАт 1811 с сериями КЗ № 10, 10/1, 12, 12/1 представлены в таблице 2. Таблица 2 – Результаты визуальной оценки реакции определения ЗЧ для МкАт 1811 и 387 с сериями КЗ № 10, 10/1, 12, 12/1.
Кроме визуального определения «золотого числа» оценивали оптическую плотность содержимого лунок на планшетном спектрофотометре, измеряя ее при длине волны λ = 630 нм. По результатам определения строили кривую зависимости оптической плотности содержимого лунок от концентрации антител. На графике определяли точку выхода на плато (х мкг·см-3).
Рис. 1 – Результаты определения «золотого числа» для МкАт 387 и 1811 с серией КЗ № 10/1 при постановке реакции на 0,005 М КББ. Из данных, представленных на рисунке 1, следует, что точка выхода на плато соответствует концентрация МкАт: для МкАт 1811 – 3,125 мкг·см-3 , для МкАТ 387 – 12,5 мкг·см-3. По результатам визуальной оценки и спектрофотометрии были определены серии КЗ с наибольшей адсорбционной способностью – №10/1 и 12/1, а также выбраны МкАт 387 для последующей посадки на наночастицы КЗ соответствующих серий препаратов. Для МкАт 387 был выбран диапазон концентраций антител от Приготовление концентраций МкАт отличающихся друг от друга на а) готовили необходимый объем раствора МкАт с концентрацией б) в первый эппендорф вносили 450 мкл, а в остальные 9 по 400 мкл раствора МкАТ с концентрацией 25 мкг·см-3; в) для получения концентрации антител 23, 21, 19, 17, 15, 13, 11, 9, 7 мкг·см-3 , начиная со 2-го эппендорфа, вносили 0,005 М КББ в объеме 36, 76, 128, 188, 268, 368, 508, 712, 1028 мкл, соответственно. Далее проводили постановку реакции с целью определения «золотого числа» в планшетах: 1. Вносили в лунки А1-D1 первого вертикального ряда по 100 мкл МкАт с концентрацией 25 мкг·см-3, в лунки А2-D2 второго вертикального ряда по 100 мкл МкАт с концентрацией 23 мкг·см-3 , в лунки А3-D3 третьего вертикального ряда по 100 мкл МкАт с концентрацией 21 мкг·см-3 , в лунки А4-D4 четвертого вертикального ряда по 100 мкл МкАт с концентрацией 19 мкг·см-3, в лунки А5-D5 пятого вертикального ряда по 100 мкл МкАт с концентрацией 17 мкг·см-3, в лунки А6-D6 шестого вертикального ряда по 100 мкл МкАт с концентрацией 15 мкг·см-3 , в лунки А7-D7 седьмого вертикального ряда по 100 мкл МкАт с концентрацией 13 мкг·см-3; в лунки А8-D8 восьмого вертикального ряда по 100 мкл МкАт с концентрацией 11 мкг·см-3, в лунки А9-D9 девятого вертикального ряда по 100 мкл МкАт с концентрацией 9 мкг·см-3 , в лунки А10-D10 десятого вертикального ряда по 100 мкл МкАт с концентрацией 7 мкг·см-3. 2. В каждую лунку двух горизонтальных рядов (в 2-х повторностях) вносили по 100 мкл КЗ, не задевая носиком содержимое лунок: в лунки рядов А-В – КЗ 10/1, С-D – 12/1. 3. Содержимое лунок инкубировали 15 мин. 4. По окончанию инкубации в каждую лунку вносили по 22 мкл 10%-ного раствора натрия хлорида. Конечная концентрация NaCl в каждой лунке при этом составила 1%. 5. Содержимое лунок перемешивали справа-налево. 6. Инкубировали 10 мин. Результаты постановки реакции определяли визуально и на спектрофотометре, измеряя спектр содержимого лунок планшета при длине волны λ = 630 нм. По результатам спектрофотометрии строили кривую зависимости оптической плотности содержимого лунок от концентрации антител. На графике определяли точку выхода на плато (х мкг·см-3). Золотое число определяли как х + 15% [87].
Рис. 2 – Зависимость спектра поглощения от концентрации МкАТ при длине волны 630 нм при титровании антител в диапазоне от 25 мкг·см-3 до 12,5 мкг·см-3 с интервалом 2 мкг·см-3. Из данных, представленных на рисунке 2, следует, что «золотое число» (точка выхода графика на плато) для МкАТ 387 и серии КЗ № 10/1 соответствует 17 мкг·см-3, для МкАТ 387 и серии КЗ № 12/1 соответствует
2.2.3 Результаты экспериментального обоснования состава В результате проведенных исследований теоретически обоснована и экспериментально отработана методика приготовления наночастиц КЗ с диаметром 30 нм. Для получения кондиционного коллоидного золота с размером частиц 30 нм необходимо: 1) приготовить 50 мл 1% раствора 5,5-водного цитрата натрия: 0,69 г 5,5-водного цитрата натрия растворить в 50 мл деионизированной воды; 2) приготовить 10% раствор золохлористоводородной кислоты (HAuCl4·3H2O): к 1 г HAuCl4 добавить 10 мл деионизированной воды; 3) в колбу Эрленмейера добавить 50 мл деионизированной воды и поместить магнитную мешалку. Надеть на колбу обратный холодильник, поставить колбу с содержимым на магнитную плитку и установить на плитке режим 375 об/мин и температуру 300◦С; 4) через 6 мин (по отработанной в дипломной работе методике – время от момента постановки колбы с содержимым на плитку до начала стекания конденсата) внести 0,058 мл 10% раствора КЗ [1], кипятить 2 мин; 5) внести 0,72 мл 1% раствора 5,5-водного цитрата натрия; 6) при изменении цвета раствора с синего на красный изменить режим на магнитной плитке на 500 об/мин и снизить температуру до 200 ◦С; 7) кипятить раствор еще 20 мин; 8) выключить магнитную плитку, снять обратный холодильник, остудить раствор при комнатной температуре и оставить до следующего дня с целью оценки на наличие осадка. Хранить в холодильнике при 4 оС. С использованием описанной выше и отработанной по результатам данной работы методики для дальнейшего применения с целью разработки иммунохроматографической тест-системы для выявления H.pylori рекомендованы серии КЗ №10/1 и 12/1. Характеристика препаратов КЗ серий № 10/1 и 12/1 представлена в таблице 4. Таблица 4 – Характеристики препаратов КЗ серий 10/1 и 12/1
Для получения конъюгата с вышеуказанными сериями КЗ рекомендованы МкАт 387. Из данных, представленных в данной работе, следует, что «золотое число» (точка выхода графика на плато) для МкАТ 387 и серии КЗ № 10/1 соответствует 17 мкг·см-3, для МкАТ 387 и серии КЗ № 12/1 соответствует 19 мкг·см-3. С учетом данных литературы [87] рекомендуемая концентрация антител для конъюгации с сериями КЗ № 10/1 и 12/1 составляет, соответственно, 19,5 мкг·см-3 и 23,0 мкг·см-3.
Выводы по разделу – Теоретически обоснована и экспериментально отработана методика приготовления наночастиц КЗ с диаметром 30 нм. Для приготовления 50 мл наночастиц КЗ с размером 30 нм в колбу Эрленмейера необходимо добавить 50 мл деионизированной воды, поместить в нее магнитную мешалку, надеть на колбу обратный холодильник, поставить колбу с содержимым на магнитную плитку и установить на плитке режим 375 об/мин и температуру 300◦С. Через 6 мин от момента постановки колбы с содержимым на плитку внести 0,058 мл 10% раствора КЗ, кипятить 2 мин, после чего внести 0,72 мл 1% раствора 5,5-водного цитрата натрия. При изменении цвета раствора с синего на красный изменить режим на магнитной плитке на 500 об/мин и снизить температуру до 200 ◦С. Кипятить раствор 20 мин. Через 20 мин выключить плитку, снять обратный холодильник, остудить раствор при комнатной температуре. Хранить в холодильнике при 4 оС; – при отработке методики приготовления наночастиц КЗ с заданным размером экспериментально получено 12 серий препарата; – с использованием метода электронной микроскопии и спектрофотометрии проведена оценка полученных серий КЗ и выбраны наиболее кондиционные по данному этапу исследования серии КЗ № 10, № 10/1, № 12, № 12/1 с размером частиц от 15 до 30 нм; – с помощью постановки реакции по определению «золотого числа» проведена оценка адсорбционной способности четырех серий КЗ с выбранными для разработки иммунохроматографической тест-системы МкАт к Сag белку H.pylori – МкАт 1811 и МкАт 387; – теоретически и экспериментально обоснован состав конъюгата коллоидного золота с антителами для разработки иммунохроматографической тест-системы, предназначенной для идентификации H.pylori: серии коллоидного золота 10/1 и 12/1 и МкАт к Сag белку H.pylori клон 387 с концентрацией, соответственно, 17 мкг·см-3 и 19 мкг·см-3.
Приложение А (справочное)
Популярное: Почему двоичная система счисления так распространена?: Каждая цифра должна быть как-то представлена на физическом носителе... Организация как механизм и форма жизни коллектива: Организация не сможет достичь поставленных целей без соответствующей внутренней... Почему стероиды повышают давление?: Основных причин три... Как распознать напряжение: Говоря о мышечном напряжении, мы в первую очередь имеем в виду мускулы, прикрепленные к костям ... ©2015-2024 megaobuchalka.ru Все материалы представленные на сайте исключительно с целью ознакомления читателями и не преследуют коммерческих целей или нарушение авторских прав. (737)
|
Почему 1285321 студент выбрали МегаОбучалку... Система поиска информации Мобильная версия сайта Удобная навигация Нет шокирующей рекламы |