Определение общего азота в растениях, расчет содержания протеина. Метод определения нитратного азота в растениях

Определение содержания общего азота по Кьельдалю

Азот, поглощённый растением в процессе вегетации, распределя­ется по органам растений неравномерно. Более высокое содержание азота наблюдается в генеративных органах, особенно в зерне, и меньше его концентрация в листьях, стеблях, корнях, корнеплодах, очень мало в соломе. Общий азот в растении представлен двумя формами: азотом белковым и азотом небелковых соединений. К последним относится азот, входящий в состав амидов, свободных аминокислот, нитратов и аммиака.

Содержание белка в растениях определяют по количеству белкового азота. Содержание белкового азота (в процентах) умножают на коэффициент 6,25 при анализе вегетативных органов и корнеплодов и на 5,7 при анализе зерна.

На долю небелковых форм азота приходится в вегетативных органах 10-30% от общего азота, а в зерне - не более 10%. Содержание небелкового азота к концу вегетации снижается, поэтому в производ­ственных условиях, особенно при анализе кормов, долей небелкового

азота пренебрегают. Определяют в этом случае общий азот (в процентах) и его содержание пересчитывают на белок. Этот показатель называется «сырой белок».

Принцип метода. Навеску растительного материала озоляют в колбе Кьельдаля концентрированной серной кислотой в присутствии одного из катализаторов: металлического селена, перекиси водорода, хлорной кислоты и т.п. Температура озоления 332° С. В процессе гидролиза и окисления органической массы азот в колбе сохраняется в растворе в виде сульфата аммония. Для освобождения аммиака используют 40%-ный раствор щёлочи:

(NH₄)₂SO₄ + 2 NaOH -» Na₂SO₄ + 2 NH₄OH.

Отгон аммиака ведут в аппарате Кьельдаля при нагревании и кипении раствора. В кислой среде нет гидролитической диссоциации сульфата аммония, парциальное давление аммиака равно нулю. В щелочной среде происходит смещение равновесия, и в растворе образуется аммиак, который при нагревании легко улетучивается:

2 NH₄OH = 2 NH₃t + 2 Н₂О.

Аммиак не теряется, а переходит по холодильнику вначале в виде газа, а затем, конденсируясь, каплями попадает в приёмник с титрованной серной кислотой и связывается ею, вновь образуя сернокислый аммоний:

2 NH₃ + H₂SO = (NH₄)₂SO₄.

Избыток кислоты, не связанный с аммиаком, оттитровывается щёлочью точно установленной нормальности по комбинированному индикатору или по метилроту.

Ход анализа

На аналитических весах взять навеску растительного материала 0,3 - 0,5 ± 0,0001 г с помощью пробирки (по разности между весом про­бирки с навеской и весом пробирки с остатками материала) и, надев на конец пробирки резиновую трубку длиной 12-15 см, осторожно опустить навеску на дно колбы Кьельдаля. Прилить в колбу небольшим цилиндром 10-12см³ концентрированной серной кислоты (d = 1,84). Равномерное озоление растительного материала начинается уже при комнатной температуре, поэтому залитые кислотой навески лучше оставить на ночь.

Поставить колбы на электроплитку или специальную установку и проводить постепенное сжигание вначале на слабом огне (положить асбест), затем на сильном, периодически осторожно взбалтывая. Когда раствор станет однородным, прибавить катализатор (несколько кристал­лов селена или несколько капель перекиси водорода) и продолжить сжигание до полного обесцвечивания раствора.

Отгон аммиака. После окончания сжигания колбу Кьельдаля охлаждают и в неё осторожно приливают по стенкам дистиллированную воду, перемешивают содержимое и ополаскивают горлышко колбы. Первую порцию воды наливают до горлышка и количественно переносят в круглодонную колбу ёмкостью 1 дм³. Колбу Кельдаля ещё 5 - 6 раз промывают небольшими порциями горячей дистиллированной воды, сливая каждый раз промывные воды в отгонную колбу. Наполняют отгонную колбу промывными видами до 2/3 её объёма и добавляют 2 -3 капли фенолфталеина. Малое количество воды затрудняет парообразо­вание при отгоне, а большое может вызвать переброс кипящей воды в холодильник.

В коническую колбу или химический стакан ёмкостью 300 -400 см³ (приёмник) наливают из бюретки 25-30 см³ 0,1 н. H₂SO₄ (с точно установленным титром), добавляют 2-3 капли индикатора метилрота или реактива Гроака (лиловая окраска). Кончик трубки холодильника по­гружают в кислоту. Отгонную колбу ставят на нагреватель и подсоединя­ют к холодильнику, проверяя герметичность соединения. Для разрушения сернокислого аммония и отгона аммиака используют 40%-й раствор щёлочи, взятый в таком объёме, который в четыре раза превосходит объём концентрированной серной кислоты, взятой при сжигании пробы (при 10 см³ кислоты берут 40 см³ щёлочи).

Отгонную колбу прямо на нагревателе открывают, наклоняют, в левой руке удерживают колбу и пробку холодильника. В колбу по стенке приливают отмеренное количество щёлочи так, чтобы она опустилась вся на дно колбы, и пробку холодильника быстро закрывают. Это вызвано тем, что реакция взаимодействия щёлочи и сульфата аммония начинается и без нагревания, что приводит к потерям аммиака. Горлышко колбы нельзя по всей поверхности заливать щёлочью, так как пробка холодильника выскочит при кипячении.

Закрытую колбу осторожно и тщательно взбалтывают круговыми движениями, при этом в стакан-приёмник проскакивают первоначально пузырьки воздуха. Раствор в колбе сначала становится красного цвета, а затем темнеет, и при нагревании появляется объёмный осадок. Включают нагреватель и холодильник и приступают к отгону аммиака. Через 20 -25 мин после начала отгона опускают стакан-приёмник так, чтобы раствор аммиака из холодильника стекал по стенке стакана. Кипение в отгонной колбе должно быть равномерным и достаточно интенсивным,

иначе кислота из стакана будет засасываться в холодильник за счёт перепада внутреннего и наружного давления газов. Если засасывание началось, надо усилить нагрев отгонной колбы и вынуть конец трубки холодильника из раствора кислоты, для этого опустить стакан-приёмник.

Отгон считать законченным, когда содержимое отгонной колбы испарится до 1/3 первоначального объёма. Полноту отгона аммиака проверяют универсальным индикатором, лакмусом или реактивом Несслера, для чего берут несколько капель из холодильника на индика­торную бумагу или в пробирку, куда добавлен реактив Несслера. Он даёт с аммиаком жёлтое окрашивание.

Если в процессе отгона жидкость в приёмнике изменит окраску, необходимо добавить точно фиксированное количество 0,1 н. H2SO4 (20 см³), так как первоначального объёма кислоты не хватило для связывания аммиака.

По окончании отгона носик холодильника споласкивают дистил­лированной водой из промывалки в приёмник.

Содержимое приёмника титруют 0,1 н. раствором едкого кали, перемешивая осторожно стеклянной палочкой, до перехода окраски метилового красного в бесцветную, а по реактиву Гроака - от лиловой в светло-зелёную. Здесь интенсивность окраски зависит от количества индикатора.

Количество аммиака находят по разности между количеством кислоты в приёмнике, первоначально прилитой, и количеством кислоты, которая не связалась с аммиаком и оттитрована впоследствии щёлочью.

Занятие № 8