РАЗДЕЛЕНИЕ ИНДИВИДУАЛЬНЫХ БЕЛКОВ

 

Особенности строения и функционирования организма зависят от набора белков, синтезирующихся в нем. Изучение строения и свойств белков невозможно без их выделения из клетки и очистки от других белков и органических молекул. Стадии выделения и очистки индивидуальных белков:

1 Разрушение клетокизучаемой ткани и получение гомогената.

2 Разделение гомогената на фракциицентрифугированием, получение ядерной, митохондриальной, цитозольной или иной фракции, содержащей искомый белок.

3 Избирательная тепловая денатурация- кратковременное нагревание раствора белков, при котором можно удалить часть денатурированных белковых примесей (в том случае, если белок относительно термостабилен).

4 Высаливание.Различные белки выпадают в осадок при разной концентрации соли в растворе. Постепенно повышая ее концентрацию, можно получить ряд отдельных фракций с преимущественным содержанием выделяемого белка в одной из них. Наиболее часто для фракционирования белков используют сульфат аммония. Белки с наименьшей растворимостью выпадают в осадок при небольшой концентрации солей.

5 Гель-фильтрация- метод молекулярного просеивания молекул через набухшие гранулы сефадекса (трехмерные полисахаридные цепи декстрана, имеющие поры). Скорость прохождения белков через колонку, заполненную сефадексом, будет зависеть от их молекулярной массы:чем меньше масса молекул, тем легче они проникают внутрь гранул и дольше там задерживаются, чем больше масса, тем быстрее они элюируются с колонки.

6 Ультрацентрифугирование- метод, заключающийся в том, что белки в центрифужной пробирке помещают в ротор ультрацентрифуги. При вращении ротора скорость оседания белков пропорциональна их молекулярной массе: более тяжелые белки образуют фракции, расположенные ближе ко дну кюветы, более легкие - к поверхности.

7 Электрофорез- метод, в основе которого лежат различия в скорости движения белков в электрическом поле. Эта величина пропорциональна заряду белков. Электрофорез белков проводят на бумаге (где скорость движения белков пропорциональна только их заряду) или в полиакриламидном геле, имеющем определенную величину пор (скорость движения белков пропорциональна их заряду и молекулярной массе).

8 Ионообменная хроматография- метод фракционирования, основанный на связывании ионизированных групп белков с противоположно заряженными группами ионообменных нерастворимых полимеров. Прочность связывания белка со смолой пропорциональна заряду белка.Белки, адсорбированные на ионообменном полимере, можно смыть возрастающими концентрациями NaСl; чем меньше заряд белка, тем меньшая концентрация NaСl потребуется, чтобы смыть белок, прикрепленный к ионогенным группам смолы.

9 Аффинная хроматография- наиболее специфический метод выделения индивидуальных белков. К инертному полимеру ковалентно присоединяется лиганд какого-либо белка. При пропускании раствора белков через колонку с полимером за счет комплементарного связывания белка с лигандом на колонке адсорбируется только специфичный для данного лиганда белок.

10Для удаления низкомолекулярных соединений из раствора выделяемого белка применяют диализ.Метод основан на неспособности белков проходить через полупроницаемую мембрану, легко пропускающую низкомолекулярные вещества, в частности соли. Применяется для очистки белков от низкомолекулярных примесей, например от солей после высаливания.

 

Задания

1 Определите суммарный заряд пентапептида при рН 7,0:

Глу—Арг—Лиз—Вал—Асп

Как изменится суммарный заряд этого пептида:

а) при рН<7,0;

б) при рН >7,0?

2 Определите ИЭТ пептидов (>, < или =7,0):

а) Про—Лиз—Тир—Глн—Три;

б) Ала—Сер—Глу—Асн—Мет.

3 Сравните направление движения в электрическом поле двух пептидов при рН 7,0 (к катоду или аноду):

а) Вал—Глу—Ала;

б) Лей—Асн—Арг.

4 Сравните растворимость двух пептидов при рН 7,0:

Сер—Цис—Глу—Тир—Асп;

Вал—Арг—Мет—Фен—Тир.

5 В ядерных белках-гистонах содержится большое количество аминокислотных остатков аргинина и лизина, а в белке крови альбумине – много остатков глутаминовой и аспарагиновой кислот. Ответьте на вопросы:

а) в каких средах (>, < или =7,0) лежит ИЭТ этих белков?

б) с каким из двух белков может взаимодействовать Са²⁺?

6 Подберите к пронумерованному методу разделения и очистки белков их соответствующие свойства, на которых основан данный метод:

А) Различия по величине заряда.

Б) Различия по молекулярной массе.

В) Оба.

Г) Ни один.

1 Гель-фильтрация.

2 Электрофорез в полиакриламидном геле.

3 Аффинная хроматография.

4 Ионообменная хроматография.

А) Ультрацентрифугирование.

Б) Гель-фильтрация.

В) Электрофорез в полиакриламидном геле.

Г) Ионообменная хроматография.

Д) Аффинная хроматография.

1 Используется для отделения белка от соли.

2 Метод основан на присоединении белка к иммобилизованному лиганду.

3 В основе метода лежит использование различий в молекулярной массе и заряде белков.

8 Выберите методы, с помощью которых можно разделить смесь белков на индивидуальные белки; укажите физико-химические свойства белков, лежащие в основе каждого метода.

 

 

Название	Молекулярная масса, Д	ИЭТ белка
Церулоплазмин	151 000	4,4
g-Глобулин	150 000	6,3
b-Лактальбумин	37 000	5,2

9 Как суммарный заряд белка влияет на его растворимость:

а) определите суммарный заряд пептида при рН 7,0

Ала—Глу—Тре—Про—Асп—Лиз—Цис;

б) как изменится заряд этого пептида при рН >7,0, рН<7,0, рН<<7,0?

в) что такое изоэлектрическая точка (ИЭТ) белка и в какой среде лежит ИЭТ данного пептида?

г) при каком значении рН будет наблюдаться наименьшая растворимость данного пептида?

10 Почему кислое молоко в отличие от свежего при кипячении сворачивается (т.е. белок молока казеин выпадает в осадок)? В свежем молоке молекулы казеина имеют отрицательный заряд.

11 Решите задачу.Смесь, содержащую белки А, В и С с молекулярной массой соответственно 160 000, 80 000 и 60 000 Д, анализировали методом гель-фильтрации. Гранулы набухшего геля проницаемы для белков с мол. массой менее 70 000 Д. Укажите возможные варианты порядка выхода белков А, В и С из колонки.

12 Сравните использование метода диализа и гель-фильтрации:

1 Метод используется для очистки белков от низкомолекулярных соединений.

2 Метод используется для фракционирования высокомолекулярных веществ по различию молекулярной массы.

3 Метод используется для разделения белков по суммарному заряду.

4 Метод используется для определения молекулярной массы.

А) Характерно для диализа.

Б) Характерно для гель-фильтрации.

В) Характерно для обоих методов.

Г) Нехарактерно ни для одного из них.

 

5.3 Контрольные вопросы

1 От чего зависит растворимость белков?

2 Опишите этапы выделения и очистки белков. Что такое лиофилизация?

3 Молекулярная масса белков и методы ее определения.

4 Амфотерные свойства белков. Изоэлектрическая точка.

 

 

Список используемой литературы

1 Биохимия // под ред. Е.С.Северина, А.Я.Николаева. – М: ГЭОТАЗ-МЕД. 2001. – 449с.

2 Пластинина З.А., Жамсаранова С.Д. Методические указания для самостоятельной подготовки к лабораторным занятиям по биологической химии. - Улан-Удэ: Изд-во ВСГТУ, 2003. - 109 с.

3 Филиппович Ю.Б. Биохимия белка и нуклеиновых кислот. - М.: Просвещение. 1978. - 203 с.

4 Анисимов А.А. и др. Основы биохимии. - М.: Высш. шк., 1985. - 398с.

5 Филиппович Ю.Б., Егорова Т.А., Севастьянова Г.А. Практикум по общей биохимии. - М.: Просвещение, 1982. - 157 с.

6 Остроумов С.А. Введение в биохимическую экологию. - М.: Мир, 1986. -

253 с.

7 Уильямс Б., Уилсон К. Методы практической биохимии. - М.:Мир, 1978. - 268 с.