Лекция по клинической биохимии

“Молекулярная лабораторная диагностика”

Молекулярная диагностика – наука, занимающаяся выявлением патологий, изучением на молекулярном уровне причин их возникновения и механизмов развития. Молекулярный уровень включает не только ДНК и мРНК, но и соответствующие белковые продукты. Развитие молекулярной диагностики, появившейся на основе биохимии и молекулярной биологии, началось с 70-х годов благодаря двум открытиям: моноклональных антител и метода гибридизации на фильтрах. В результате первого открытия появилась возможность получать в больших количествах антитела, взаимодействующими с определнными эпитопами. Антитела могут выступать в качестве звеньев для выявления и определения количества молекул в клеточных экстрактах, идентификации специфических белков после их разделения в полиакриламидном геле. При связывании антител с инертным матриксом получают аффинные колонки, пригодные для выделения и очистки специфических молекул из грубых клеточных экстрактов. Второе открытие позволило повысить разрешение существующего метода электрофореза нуклеиновых кислот и белков (перенос макромолекул на фильтры с последующей гибридизацией со специфичными мечеными зондами). Несколько позже были описаны методы определения первичной структуры нуклеиновых кислот, а затем была разработана полимеразная цепная реакция (1985 г.). В рамках молекулярной диагностики возможно фенотипирование клеток и генотипирование клеток. Таким образом, молекулярная диагностика подразумевает геномную характеристику мутаций и полиморфизма генов, амплификацию НК методом ПЦР, анализ профиля экспрессии генов и белков в клетках, специфическую детекцию нормальных и мутантных белков. Молекулярная диагностика абсолютно необходима для дифференциальной диагностики, пренатальной диагностики, ранней диагностики, а также диагностики генетической предрасположенности к развитию заболевания. В молекулярной диагностике, в отличие от классических методов (морфологический анализ клеток, биохимические методы, идентификация инфекционных агентов), диагностическими мишенями являются ДНК, РНК и белки. Методы молекулярной диагностики позволяют осуществлять анализ индивидуального патогенеза заболевания, индивидуальный прогноз заболевания, выявлять заболевание до клинической симптоматики, оценивать вклад различных экзогенных и эндогенных факторов в развитие заболевания, разрабатывать индивидуальные фармакологические подходы к лечению заболевания, а также меры профилактики заболевания. Таким образом, на сегодняшний день развитие так называемой доказательной медицины позволяет ставить диагноз на геномном и протеомном уровнях.

Иммуноцитохимия и иммуногистохимия – локализация антигенов (структурные компоненты клетки, рецепторы, ферменты, ионные каналы) в клетках и тканях с использованием моноклональных антител. Реакция может проводиться на фиксированных тканях, в живых клетках, в мазках-отпечатках и т.д. В основе методы лежит взаимодействие антитела (одного или нескольких) с антигеном, находящимся на поверхности клетки или внутриклеточно (для идентификации таких антигенов используют пермеабилизацию клеток), меченого флуоресцентным красителем или иммуноферментным комплексом (например, пероксидаза-антипероксидаза, щелочная фосфатаза-антищелочная фосфатаза (щелочная фосфатаза участвует в реакции образования неорганического фосфата, поэтому связывание фермента со вторичным антителом позволяет использовать чувствительный химический тест на фосфат для выявления комплекса антиген-антитело), авидин-биотиновой системой (низкомолекулярный витамин биотин имеет высокое сродство к бактериальному белку стрептавидину, при ковалентном связывании первичных антител с биотином можно прямо пометить стептавидин маркером и использовать его вместо вторичных антител). Маркерную молекулу (например, флуоресцирующий краситель) можно прямо связывать с антителами и использовать для определния антигена (первичные антитела), однако еще большего усиления сигнала можно добиться, применяя немеченые первичные антитела и затем выявляя их с помощью меченых вторичных антител, связывающихся с первичными антителами. Схематически этапы можно представить себе следующим образом: подготовка клеток (фиксация, пермеабилизация, «отбеливание», обработка первичными антителами, отмывка (для ликвидации фонового окрашивания), обработка вторичными антителами, взаимодействующими с эпитопами первичных антител и имеющими соответствующую метку, визуализация, которая осуществляется при помощи световой, флуоресцентной или электронной микроскопии, проточной цитометрии. Основные проблемы: фоновое (неспецифическое) окрашивание, может быть связано, например, с присутствием эндогенных флуорофорных молекул (флавины, пиридиновые нуклеотиды) или собственной ферментатитвной активностью клеток. Пример – иммунофенотипирование клеток крови и костного мозга, опухолей. Возможна одновременная детекция нескольких антигенов.

Проточная цитометрия (развивается в течение последних 30 лет) – основана на том, что клетки или ядра клеток по одиночке пересекают сфокусированный световой пучок, обычно лазерный. Свет определенной длины волны возбуждает молекулы флуоресцирующих красителей, связанных с различными клеточными компонентами, при этом может происходить одновременное возбуждение нескольких разных красителей, что позволяет оценивать сразу несколько клеточных параметров. Свет, испускаемый красителями, собирают с помощью системы линз и зеркал и разлагают на компоненты. Световые сигналы детектируют, преобразуют в электрические импульсы и далее в форму, удобную для компьютерной обработки и хранения информации. При проточной цитометрии можно сканировать от 100 до нескольких тысяч клеток в секунду (клеточные суспензии или дезагрегированные солидные ткани). Методом проточной цитометрии можно получать самые разные данные: определять содержание в клетке ДНК и РНК, суммарное количество белков и количество специфических белков, узнаваемых моноклональными антителами, исследовать клеточный метаболизм (например, измерять внутриклеточный рН). Изучать транспорт кальция и кинетику ферментативных реакций. Самое простое применение проточной цитометрии – измерение содержания ДНК, позволяющее четко различать клетки, находящиеся в различных фазах клеточного цикла, после связывания ДНК с красителем (например, пропидия иодид: возбуждение 488 нм, эмиссия – 620 нм). Это имеет большое клиническое значение, так как установлено, что опухоли, для которых характерны анеуплоидия и наличие большого числа клеток в S-фазе, более агрессивны. Одновременно можно определять колоссальное количество антигенов (рецепторов, ферментов, транскрипционных факторов, онкобелков). С помощью проточной цитометрии возможно определение трансмембранного митохондриального потенциала.

Гибридизация in situ – метод прямого выявления нуклеиновых кислот в клеточных структурах в условиях, позволяющих одновременно исследовать их морфологию. Известно, что если денатурацию ДНК проводить при температуре 65 С, то комплементарные цепи легко спариваются (ренатурация или гибридизация). Генетический материал иммобилизован в твердом субстрате (т.е. в интактной клетке), в качестве зонда используется фрагмент НК, комплементарный к той последовательности, которую нужно обнаружить, этот зонд имеет длину 15-1000 нуклеотидов, обычно его интенсивно метят 32Р. Используются срезы фиксированных тканей, после депарафинизации производят демаскирование нуклеиновых кислот: в клетках НК находится в контакте с другими клеточными компонентами и при фиксации альдегидами оказывается сшитой с другими НК или белками. Для демаскирования проводят ограниченный протеолиз (например, протеиназой К). Затем образец обрабатывается ДНКазой или РНКазой, чтобы повысить специфичность гибридизации ДНК-ДНК или РНК-РНК. Следующий этап – денатурация: если объект исследования – жвухцепочечная ДНК и используется двухцепочечный зонд, необходимо денатурировать обе молекулы, денатурировать одноцепочечную мРНК и рибо-зонды нет необходимости, хотя денатурация ведет к усилению сигнала, вероятно, вследствие разрушения вторичной структуры. Использует химическую или термическую денатурацию, обычно в присутствии формамида и слей (формамид ослабляет внутримолекулярные водородные связи в зонде и в последовательности-мишени). Следующий этап – гибридизация последовательности-мишени и меченого зонда, отмывка от непрореагировавшего зонда и детекция (радиоавтография, флуоресцентная микроскопия, световая микроскопия фермента-индикатора). Если в ткани присутствует НК, комплементарная зонду, происходит гибридизация. В качестве ДНК-зондов используются последовательности ДНК «в чистом виде» или в составе плазмидного вектора. Для получения РНК-зондов используют нерадиоактивные гаптены, присоединенные к нуклеотидоам (при синтезе РНК заменяют уридин его аналогами, а затем к каждому аналогу присоединяют биотин или в РНК включают УТФ, уже меченный биотином или дигоксигенином). В последнее время получают и ПЦР-зонды, имеющие заданную длину, определенную нуклеотидную последовательность, высокую специфичность (за счет амплификации сегмента ДНК, расположенного между участками с известной последовательностью нуклеотидов). Метод гибридизации in situ используется для выявления в клиническом материале вирусных нуклеиновых кислот, определения хромосомоспецифичных последовательностей в интерфазном ядре, локализации в материале специфических мРНК. Например, для выявления генетических нарушений в опухолевых клетках используются ДНК-зонды, которые гибридизуются с высокоповторяющимися сегментами хромосом в основном из центромерных и теломерных районов (сателлитная ДНК). Последовательности-мишени для этих зондов представлены копиями от сотен до тысяч (несколько тысяч п.н.). Таким методом были обнаружены генетическая гетерогенность в популяции опухолевых клеток, тетраплоидизация опухолевых клеток, различные варианты геномных нарушений в опухолевых клетках. Недостаток метода: для выявления нуклеиновой кислоты-мишений методом гибридизации in situ необходимо, чтобы мишень присутствовала в препаратах в нескольких тысяч копий.

Гибридизация нуклеиновых кислот и белков на фильтрах (Саузерн-блоттинг, Нозерн-блоттинг и Вестерн-блоттинг) – метод, позволяющий идентифицировать наличие того или иного типа нуклеиновых кислот или белков в материале, определить характер их изменения (например, конформационные нарушения, химические модификации, присутствие экзогенных НК или белков). Саузерн-блоттинг – анализ ДНК, Нозерн-блоттинг – анализ РНК, Вестерн-блоттинг – анализ белков. Обычно макромолекулы переносятся на мембранные фильтры после их фракционирования в агарозном геле. Например, при переносе ДНК фрагменты, полученные путем гель-электрофореза, переносят на фильтр за счет капиллярных сил. Нативная РНК, обладающая вторичной структурой, не способна эффективно связываться с мембранными фильтрами, поэтому ее сначала денатурируют (переводят в полностью одноцепочечную форму), потом фракционируют с помощью гель-электрофореза, затем переносят на мембранный фильтр. Образцы РНК и ДНК «пришивают» к фильтру с помощью УФО (нейлоновый фильтр) или «прожариванием» при +80 С (нитроцеллюлозный фильтр). Чтобы обнаружить и локализовать последовательности-мишени, детекцию гибридизовавшихся зондов осуществляют радиоавтографически или с использованием биотиновой метки.

Полимеразная цепная реакция– это осуществляемая in vitro специфическая амплификация нуклеиновых кислот, инициируемая синтетическими олигонуклеотидными праймерами. ПЦР-цикл состоит из тепловой денатурации ДНК, ее отжига с праймером и удлинения цепи, смена этих этапов осуществляется в результате простого изменения температуры. Праймеры при этом ориентируются на матрице так, что число раундов репликации растет экспоненциально, соответственно увеличивается и число копий специфической нуклеотидной последовательности. Реакция удлинения цепи осуществляется в присутствии дезоксинуклеозидтрифосфатов. ПЦР обладает очень высокой чувствительностью и специфичностью, позволяет выявить уникальную нуклеотидную последовательность, для чего в реакционную смесь добавляют в большом избытке специфичные для данной последовательности олигонуклеотидные праймеры, которые образуют с ней комплекс, и проводят репликацию ДНК in vitro. Поскольку праймеры гибридизуются с обеими цепями ДНК, то и нативная последовательность, и синтезируемые ПЦР-продукты могут служить матрицами в последующих раундах репликации. Благодаря этому последовательности, присутствующие в клиническом препарате в минимальном количестве (одна или несколько копий на 100 000 – 1000000 клеток) и не поддающиеся обнаружению никакими другими методами, легко выявляется с помощью ПЦР. Каждый раунд репликации занимает 2-5 минут, обычно для достижения необходимой чувствительности достаточно 25-50 раундов (2-4 часа). Кроме того, содержание ПЦР-продуктов достаточно велико, поэтому можно использовать неизотопные методы детекции. РНК тоже можно амплифицировать с помощью ПЦР, предварительно получив ее кДНК-копию (RT-PCR). ПЦР-праймеры обычно имеют размер от 18 до 25 нуклеотидов. ПЦР-амплифицированные фрагменты ДНК имеют разный размер, он определяется суммой размера праймеров и расстояния между из 3’-концами (обычно 100-300 нуклеотидов). Скорость репликации с помощью ДНК-полимеразы Taq составляет 35-100 нуклеотидов в секунду (у этого фермента отсутствует корректирующая 3’-5’-активность и частота ошибок при считывании достигает 1/10 000 нуклеотидов). Небольшое нарушение гомологии между 3’-концом праймера и матрицей не сказывается на ходе ракции при достаточной концентрации нуклеозидтрифосфатов. При низкой концентрации нуклеозидтрифосфатов такое нарушение блокирует амплификацию. Таким образом с помощью ПЦР можно различить аллели, отличающиеся всего одним нуклеотидом. В ходе ПЦР образцы инкубируют при трех разных температурах, соответствующих трем этапам цикла: денатурация мишени (90-95 С), отжиг (40-60 С), удлинение праймера (72 С – оптимальная температура для Taq). Температура отжига определяет жесткость условий гибридизации праймеров с мишенью и, следовательно, специфичность амплификации, она зависит от длины праймеров и их GC-содержания. Электрофорез в агарозном геле позволяет легко, без применения радиоизотопов, обнаружить амплифицированную ДНК и определить ее размер. Кроме того, можно использовать и флуорофор-меченые праймеры (для количественного анализа ПЦР-продукта), меченые зонды (гибридизация ПЦР-амплифицированной ДНК по Саузерну). Метод ПЦР применяется для выявления в клинических образцах вирусов, бактерий, простейших, врожденных и приобретенных генетических нарушений, анализа генов, регулирующих различные этапы метаболизма или передачи сигнальной информации в клетках, идентификации личности.

Методы протеомики – новая область экспериментальной и клинической медицины, биологии, начала развиваться с 1995 года. Теоретическими предпосылками для развития такого рода направления стало осознание того, что несмотря на то, что в каждой клетке может быть только около 1000000 функционирующих генов, многочисленные реакции модификации могут увеличить число белков в клетке до 10-20 миллионов. Протеомика – это наука, занимающаяся инвентаризацией белков с помощью комбинированного использования методов двумерного электрофореза, масс-спектрометрического анализа молекулярной массы и последовательности разделенных электрофорезом белков с последующим анализом полученных результатов методами биоинформатики. Методами протеомики могут быть не только изучен белковый состав клеток (структурная протеомика), но и определен характер посттрансляционной модификации белков, выяснен характер взаимодействия различных белков или субъединиц в составе олигомерных комплексов (функциональная протеомика). Структурная протеомика в последнее время получила название экспрессионной протеомики, а функциональная протеомика – клеточно-картируемой протеомики. Комбинация двумерного электрофореза и масс-спектрометрии привела к совершенно непредсказуемому результату. Метод двумерного электрофореза основан на том, что на первом этапе белки раздуляются по их заряду, для этого образец помещается в небольшой объем раствора, содержащего незаряженный детергент (меркаптоэтанол), и в качестве денатурирующего агента – мочевину. В этом растворе происходит солюбилизация, денатурация и диссоциация всех без исключения полипептидных цепей, при этом изменения заряда цепей не происходит. Диссоциированные полипептидные цепи разделяют затем методом изоэлектрического фокусирования, основанном на изменении заряда белковой молекулы при изменении рН окружающей среды. При ИЭТ белки подвергаются электрофорезу в полиакриламидном геле, где создается с помощью специальных буферов градиент рН. Под действием электрического поля каждый белок перемещается в ту зону градиента, которая соответствет его изоэлектрической точке. На втором этапе трубочка геля, содержащего разделенные белки, снова подвергается электрофорезу, в направлении, перпендикулярном тому, что на первом этапе. В этом случае электрофорез ведут в присутствии ДСН и белки разделяют по их молекулярной массе. Исходный гель пропитывают додецил-сульфатом натрия и, поместив его на блок ДСН-ПААГ-геля, проводят электрофорез, в ходу которого каждая из полипептидных цепей мигрирует сквозь блок геля и образует в нем отдельную полосу. Неразделенными в результате остаются только те белки, которые неразличимы как по ИЭТ, так и по молекулярной массе. Одним из ограничений метода двумерного электрофореза являлась его плохая воспроизводимость, особенно в первом направлении, в котором белки распределялись по их изоэлектрической точке. Однако создание иммобилизованных градиентов рН позволило преодолеть эту нестабильность. Современные методы масс-спектрометрии позволяют анализировать не отдельно выделенные белки, но даже их смеси. Продолжают развиваться другие методы разделения белков на первом этапе протеомного анализа, такие, как капиллярный электрофорез, капиллярная хроматография, двумерная и многомерная хроматография. В результате ионизации образца формируется масс-спектр (набор рассортированных по массам ионов), несущий информацию о структуре молекулы. Масс-спеткрометрический анализ осуществляется с использованием время-пролетных масс-спектрометров MALDI-TOF (ионизация лазерной десорбцией при содействии матрицы, при этом лазерный луч вырывает с поверхности мишени, на которую нанесен образец со специально подобранной матрицей, ионы). В большинстве масс-спектрометров ионы движутся с магнитном или электростатическом поле, во время-пролетных масс-спектрометрах ионы движутся в бесполевом пространстве. Ионы из источника разгоняются электрическим полем, приобретая достаточно большую кинетическую энергию, и вылетают в бесполевое пространство. На входе в это пространство все ионы имеют одинаковую кинетическую энергию, следовательно, в зависимости от массы ионы будут двигаться с разными скоростями и в разное время достигнут детектора. Процессы происходят за миллионные доли секунды. Последовательность анализа такова: белки из неокрашенного двумерного геля электроблоттингом переносятся на мембрану с иммобилизованным трипсином, где они расщепляются до пептидов. Затем эти пептиды улавливаются второй мембраной, которая считывается в MALDI-TOF масс-спектрометре, в результате чего определяются молекулярные массы этих пептидов. По сути дела, содержимое пятная второй мембраны является в геле отпечатком белка в пептидной форме. Тандемные масс-спектрометры позволяют также прочитать последовательность этих пептидов. На второй стадии этого анализа ионизированные пептиды, выбранные по массе в первом масс-спектрометре, разрушаются дальше при столкновении с молекулами газа и фрагментированные остатки пептидов анализируются во втором спеткрометре. Существующие методы биоинформатики позволяют установить принадлежность того или иного пептида тому или иному белку и идентифицировать этот белок (путем сравнения с существующими базами данных). Другой метод – электроспрейная ионизация (или наноэлектроспрейная ионизация) используется для выявления модифицированных белков: интересующие органические молекулы с растворителем вырываются под давлением из узкого капилляра с оргамной скоростью, и прямо в этой струе с оболочек молекул срываются электроны, превращая их в ионы. В отличие от MALDI, полученный спрей пригоден для анализа с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографией и капиллярным электрофорезом. Таким образом, для анализа многих белков вполне достаточно определения их молекулярной массы и координат в двумерном электрофорезе, секвенирование белковых зон электрофореграмм (MALDI-TOF). Если речь идет о характеристике какой-то определенной группы белков, в том числе и модифицированных, а также белков, находящихся в метаболических комплексах, или белков, взаимодействующих друг с другом, то метод электроспрейной ионизации является методом выбора. Область применения протеомики: создание банков данных нормальных и патологических белков, изучение путей метаболизма и передачи сигнальной информации в клетках, поиск новых маркеров заболеваний, поиск новых белковых мишеней действия фармакологических препаратов.

1. Исследование одиночных клеток – новое направление в оптимизации существующих методов молекулярной диагностики. Этот подход подразумевает то, что для выявления специфических генов и продуктов их экспрессии необходим биологический материал в виде одной клетки, что особенно актуально при проведении пренатальной диагностики, диагностики рака на начальных стадиях канцерогенеза, диагностики патологических состояний в тканях, забор биологического материала из которых труден, диагностике заболеваний, при которых изменения затрагивают на начальном этапе единичные клетки из большой популяции. Так, существует разновидность ПЦР, утилизирующая ДНК из единственной клетки, например, забранной из эмбриона (на этапе преимплантационного эмбриогенеза в протоколах ЭКО), позволяющая оценивать экспрессию различных рецепторов и иммуноглобулинов на поверхностных мембранах клеток при лейкозах, обнаруживать интегрированный в геном клетки-хозяина вирусный геном. Для забора материала для ПЦР из одиночных клеток используют специальные методы (например, лазерная микродиссекция тканей). При проведении протеомного анализа единственной клетки используют метод капиллярного электрофореза, позволяющий анализировать образец объемом в несколько нанолитров Особенностью протеомного анализа единственной клетки является то, что он позволяет идентифицировать белковый профиль без предварительной очистки пептидов, без сепарации клеток и без обработки клеток, вызывающей деградацию ряда клеточных белков. Другим достонством этого метода является то, что рядом расположенные в ткани клетки могут иметь совершенно различный набор белков (например, нейроны и глиальные клетки), что затрудняет точную идентификацию белков, специфичных для данного типа клеток. Методы анализа одиночной клетки позволяют оценивать биологические эффекты гормонов, факторов роста, лигандов клеточных рецепторов, фармакологических препаратов на экспрессию генов, синтез вторичных мессенджеров, экспрессию клеточных белков, т.е. анализировать изменения метаболизма клетки.