Современные представления о строении белков – ферментов.

Для студентов – бакалавров 4-го курса стационарной формы обучения

Литература

Диксон, Уэбб "Ферменты" в 3-х томах, "Мир", - 1982.

Кретович В. Л. Введение в энзимологию"- "М. – 1967.

 

 

Вводная лекция № 1

План

Значение ферментов в жизни организмов.

Краткая история изучения ферментов.

Современные представления о строении белков – ферментов.

Учение о ферментах (энзимология) является одним из наиболее важных разделов биологической химии. Изучение ферментов представляет большое значение. эта наука находится на стыке биологических и физических наук. Так, например, ферменты имеют большое значение в биологии. Жизнь всех живых организмов зависит от сложной совокупности химических реакций, которые осуществляются специфическими ферментами. Незначительное изменение действия ферментов может повлечь за собой серьезные последствия для организма, которое выражается чаще всего его болезнью. Успешное лечение болезней зависит от нашего знания анатомии, физиологии и биохимии живого организма (растения, животного, человека). Эти знания позволяют врачам использовать вещества, которые либо ингибируют, либо стимулируют ход биохимических реакций, протекающих в больном организме. Приведу еще примеры. Вы знаете, что молоко и молочные продукты являются важными компонентами диетического питания человека. Но, оказывается не для всех людей на нашей планете. Прежде всего для европейских народов и для потомков европейских переселенцев в Америке, Австралии и Новой Зеландии. Хотя известно, что одомашнивание коз произошло в районах современного Ирана, а крупного рогатого скота в Месопотамии и оно не было связано со способностью коз или коров секретировать молоко. Коровы и кстрированные быки использовались как рабочие животные и как источник мяса и кожи. В Северную Индию скот попал из Месопотамии. В Индии коров начали доить, и они приобрели статус священных животных.. Однако молочное скотоводство, как отрасль сельхозпроизводства и соответственно селекция появились только несколько тысяч лет спустя в северных районах Европы (Ирландии, Англии, Дании, Швеции и Финляндии). Для этих стран характерно бедная почва, обильные осадки, что благоприятствовало появлению пастбищному скотоводству. Население Китая, Японии и других стран Юго-Восточной Азии , Африки и аборигенное население Южной и Центральной Америки не занимаются молочным животноводством до настоящего времени. Об этом свидетельствую публикации Жореса Медведева, доктора биологических наук, проживающего в Лондоне. Его публикации свидетельствуют, что практически все люди южных рас, имеющие черную, красную или желтую пигментацию кожи, защищающую их от ультрафиолетовой радиации солнца, теряют в возрасте от 2 до 5 лет способность к образованию лактазы – фермента, расщепляющего молочный сахар – лактозу на глюкозу и галактозу. На смену лактазе приходит фермент амилаза, расщепляющий крахмал. Это морфогенетический сигнал о необходимости перехода от материнского молока к самостоятельному кормлению. У человека гены, ответственные за синтез лактазы, также «выключались» в период выпадения молочных зубов. Однако у большинства европейцев, имеющих белую кожу без защитной пигментации, и у некоторых кочевых племен Азии (бедуинов – арабов, монголов, казахов, калмыков и некоторых других) вновь появилась способность к усвоению лактозы, как приспособительный признак. Возможность пить молоко давала этим народам и кочевым племенам преимущество в выживании не благодаря калориям или белкам, а благодаря полноценному набору в молоке необходимых для человека витаминов. Для кочевых племен молоко компенсировало дефицит растительных витаминов группы В и С, а для белых северных рас европейцев оно компенсировало недостаток витамина Д, который у южных рас образуется в коже под действием солнечного облучения.

Витамин Д, предохраняющий людей от рахита и остеомаляции (деформация костей из-за недостачи в организме витаминов. Витамин Д по химическому составу относится к производным холестерина. Витамин Д регулирует обмен кальция и фосфора при формировании костей. У большинства животных этот гормон, названный кальцитриолом, образуется в печени. У человека он образуется из прогормона гидрохолестерина в коже в результате неферментативной реакции, которая индуцируется ультрафиолетовым облучением. У людей, живущих в тропических и субтропических странах, нет потребности в поступлении витамина Д с пищей.

Образование кальцитриола в коже происходит очень быстро. Достаточно 10-15 минутного солнечного облучения лица или оголенных рук, достаточно, чтобы не возникло авитаминоза из-за недостачи витамина Д. При расселении людей в умеренные и северные широты, дети начали болеть рахитом, а взрослые – остеомаляцией, из-за того, что необходимо было защищать тело многослойной одеждой и проводить большую часть времени в помещениях. В этих условиях возникла потребность людей получать витамин Д с пищей. В прибрежных арктических районах главным его источником стала рыба и морские животные. А в сельскохозяйственных районах потребность в витамине Д в осенне-зимний период обеспечивалась в основном за счет молока, сливочного масла и сыра.

Таким образом постепенно происходил отбор популяций людей по признаку сохранения синтеза лактазы и после окончания материнского кормления. Это положительный признак, так как он обеспечивает прочность скелета. Установлено, что гены для синтеза лактазы сохранили активность и у взрослых, но в разной степени и у разных этнических групп. В настоящее время эта способность, обозначаемая как Lactase persistence, наиболее высокая у датчан, шведов, финов, эстонцев и голландцев. У русских, украинцев, поляков, венгров и чехов коэффициент активности генов синтеза лактазы в два раза ниже, чем у скандинавских народов. У итальянцев, греков, французов, испанцев и турок способность к усвоению лактозы в четыре-пять раз ниже, чем у северных народов. Очень низок этот коэффициент у евреев, арабов, иранцев и афганских народов.

У взрослого населения Японии, Китая, Вьетнама, Таиланда, Индонезии, Африки, аборегенов Америки и Австралии нет способности к усвоению лактозы. Эта особенность цветных рас была открыта сравнительно недавно, так как жидкое питьевое молоко не было до 1960-65 гг. продуктом международной торговли. У людей, не имеющих активной лактазы в кишечнике, молочный сахар проходит без расщепления в толстый кишечник, становясь здесь субстратом для бурной активности разнообразных кишечных бактерий.

Молочнокислые бактерии кишечной флоры расщепляют лактозу до молочной кислоты. Другие бактерии расщепляют лактозу и молочную кислоту с образованием уксусной, бутуровой, пропионовой и другий органических кислот, а также углекислоты, водорода, метана. Образование газа ведет к вздутию живота, болям в кишечнике, поносу и дегидратации организма. Такя же реакция на молоко обнаруживается и у небольшой части европейского населения. В Англии, примерно у 5 % населения, причем у пожилых людей, чем у молодых, обнаружена лактозная нетерпимость.

 

Также ферменты как катализаторы привлекают внимание физикохимиков. Изучение механизма действия ферментов является одним из самых увлекательных вопросов современного научного исследования.

В настоящее время ферментология превратилась в бурно развивающуюся отрасль знания. она имеет тесную связь со многими науками, особенно с биохимией и молекулярной биологией, физической химией, фармакалогией, токсикологией медициной и др. Наряду с этим энзимология имеет важное практическое значение. Об этом свидетельствует таблица 1.

Таблица 1. Некоторые примеры использования ферментов в разных отраслях промышленности, сельском хозяйстве, медицине. Как свидетельствует научная литература на сегодня описано более 3000 ферментов, а в промышленных условиях получают незначительное число. Первый патент на грибную амилазу был получен яаонским исследователем И. Такамине в 1894 г. Амилазы используют хлебопекарной и текстильной промышленности. Пептидазы – умясо-молочной и кожевенной промышленности. Полиферментные препараты(глюкоаваморин, пектоаваморин и др. – в сельском хозяйстве. В медицине используются гидролазы, например, гиалуронидаза, лидаза; протеазы, липазы, аспарагиназа, стрептаза, стрептокиназа и др. В генно-инженерной работе используются рестрикционные эндонуклеазы.

По сведениям 1990 г. на мировом рынке коммерческий оборот от реализации технических ферментных препаратов составил 800 млн. долларов. 80% всех ферментов технического назначения используют в основном в таких направлениях– для гидролиза крахмала – 40%, производства детергентов – 30%, производства сыров – 10%.. На сегодня товарооборот промышленно полученных ферментов составляет более 1 млрд. долларов на год.

Многие исследователи в различных странах мира сосредотачивают свои исследования на решении определенных проблемах энзимологии. Следует отметить, что все больше и больше научных журналов печатают статьи по энзимологии. Так, например, много статей печатается в журналах "Биохимия", "Прикладная биохимия и микробиология", "Микология и фитопатология," "Украинский ботанический журнал", "Физиология и биохимия культурных растений", "Физиология растений" и др.

Перейдем к рассмотрению второго вопроса "Краткая история иучения ферментов".

Ферментология возникла сравнительно недавно. Зарождение этой науки можно отнести к первой половине 19 в. Хотя явления брожения и переваривания пищи были известно очень давно. Первое ясное представление о ферменте появилось, по-видимому, только в 1933 году, когда ученые Пайен и Персо обнаружили в осадке солодового экстракте при добавлении спирта, термостабильное вещество. Это вещество обладало способностью превращать крахмал в сахар. Однако, ряд исследователей считает, что историю энзимологии следует начинать с 1814 года, когда действительный член Петербургской Академии наук К. Кирхгоф открыл явление превращения крахмала в сахар в высушенном ячменном солоде. Это вещество сейчас называют амилазой, а Пайен и Персо его назвали диастазой ( от греч. слова, что обозначает разделение) за его способность отделять растворимый декстрин от нерастворимой оболочки крахмальных зерен. Название "диастаза" впоследствии было распространено на все ферменты как общее наименование.

1898 г. ученый Дюкло предложил последние три буквы этого видового названия (суффикс "аза") прибавлять к корню названия того вещества, на которое данный фермент действует. Этот принцип был положен в основу номенклатуры ферментов. Однако, несколько названий пищеварительных ферментов, оканчивающихся на "ин" сохранились до настоящего времени "пепсин", "трипсин" и хемотрипсин".

Сразу же после открытия ферментов многие исследователи обратили внимание на сходство между их действием и действием дрожжей при брожении..

Во второй половине 19 века произошла научная дискуссия между двумя учеными Либихом и Пастером. Либих утверждал, что брожение и сходные процессы с ним обусловлены действием химических веществ. Пастер, в свою очередь, придерживался того мнения, что брожение неотделимо от жизнедеятельности клеток. Этот спор послужил толчком для разделения ферментов на "неорганизованные" и "организованные". Если говорить сегодняшним понятием это обозначает ферменты, которые выделяютсяклеткой во внешнюю среду и ферменты, которые функционируют в живой клетке. Научный спор Пастера и Либиха был разрешен ученым Бухнером (Бюхнер), который получил систему ферментов, которые осуществляют брожение, из дрожжевого экстракта, не содержащего дрожжевых клеток.

К концу 19 века накопились данные о структуре органических веществ. Это привело к тому, что стали говорить о специфичности ферментов. Проблемой специфичности ферментов и близком стерическом соответствии между ферментом и субстратом занимался Эмиль Фишер. На основании своих работ Фишер выдвинул положение о том, что субстрат подходит к ферменту так, как ключ подходит к замку. Вследствие определенного соответствия между ферментом и субстратом, фермент может действовать только на очень ограниченный ряд субстратов. Это является причиной существования множества различных ферментов. Изучение специфичности ферментов невозможно без выделения ферментов в чистом виде.

До 1920 г. серьезных работ по получению ферментов в чистом виде не было. Первые работа по очистке ферментов были проведены в лаборатории Вильштеттера. В этот период были выполнены работы по очистке ксантиноксидазы Диксоном и Кодомой. Следует отметить, что ни одному из указанных исследователей не удалось достичь полной очистки фермента.

Следующим этапом в истории изучения ферментов было получение ферментов в кристаллическом виде. Первым ферментом, полученным в кристаллическом виде, была уреаза. Этот фермент получил Самнер в 1926 году. За этой работой последовала серия работ Нортропаи его сотрудников. Они занимались получением в чистом виде протеолитических ферментов. В наше время число ферментов, полученных в чистом и кристаллическом виде, уже превышает 200, а число ферментов, очищенных до определенной степени, превышает 1500. Когда были получены первые белковые кристаллы, обладающие высокой ферментативной активностью, воникли сомнения относительно возможности кристаллизации самих ферментов. Предполагалось, что ферменты лишь адсорбированы на кристаллах инертного белка. Однако, Нортропи его сотрудники привели убедительные доказательства, что полученные их лабораторией белковые кристаллы сами являются ферментами. С тех пор были выделены в чистом вмде многие ферменты, причем все они также оказались белками.

На раннем этапе развития энзимологии было сосредоточено внимание ученых на изучении ферментов пищеварения и брожения. Изучением внутриклеточных ферментов занялись значительно позднее. Так, начиная с 1937 года число открытых внутриклеточных ферментов значительно возросло. Информация полученная при изучении этих ферментов, привела к более глубокому пониманию механизма многих важных для жизни процессов. Особенно процессов, лежащих в основе метаболизма, связанных с накоплением и использованием энергии. Наши знания о таких процессах, как фотосинтез, дыхание, биологическое окисление, брожение и др. значительно пополнилось благодаря выделению и изучению ферментов, ответственных за эти процессы.

Наиболее фундаментальными проблемами энзимологии являются: установление механизма действия ферментов, установление взаимосвязи химического строения ферментов с их каталитической активностью и др. С появлением изотопных методов и их применения для изучения химического строения ферментов внесли значительный вклад в наши представления о механизме действия ферментов.

Возможность получения ферментов в чистом виде привела к успешному развитию структурной энзимологии. С помощью химических методов удалось определить последовательность аминокислот в полипептидных цепях молекул ферментов. С помощью метода рентгеноструктурного анализа была установлена детальная трехмерная структура молекул некоторых ферментов, полученных в кристаллическом виде. В начале 1960-х годов Перутц и Кендрю расшифровали трехмерную структуру миоглобина и гемоглобина на атомарном уровне методом рентгеноструктурного анализа (РСА). Этот метод до настоящих дней является по сути единственным с помощью которого можно изучить пространственное строение молекулы. Разрешающая способность этого метода составляет 3,5Å. До 1975 года с помощью этого метода изучена структура молекул 70 белков. На октябрь 2003 г. изучено более 20000 и темпы изучения структуры белков стремительно возрастают. Основными сдерживающими трудностями являются – это получения монокристаллических образцов белков с достаточной степенью упорядоченности. Для получения кристаллов белка приходится опробовать иногда более тысячи различных приемов кристаллизации. Трудно себе представить, что существует столько приемов кристаллизации. В последнее время для этого используют методы генной инженерии, в основе которых лежит сайт-специфическая рекомбинация ДНК.

Рентгеновские лучи (Х-лучи) открыты Рентгеном в 1895 г. Они представляют собой поток фотонов с высокой энергией. Первые рентгенограммы белков были получены в начале 30-х годов 20 ст. в Англии Уильямом Астбюри. Этот исследователь исходил из предположения, что у фибриллярных белков пептидные цепи упорядочены и ориентированы в одном определенном направлении.

Рентгеновские лучи образуются при бомбардировке вещества электронами с большой энергией (ускоренными электронами). В качестве мишени чаще используют медь и молибден. Пролучают регнтгеновские лучи в рентгеновских трубках, которые представляют собой вакуумный двухэлектродный прибор. Образование (эмиссия) электронов происходит на катоде. Между катодом и анодом существует разность потенциалов примерно в 20 – 90кВ, которая ускоряет электроны. В результате электроны бомбардируют вещество анода. В результате электроны тормозятся, они теряют свою энергию. При столкновении ускоренных электронов с анодом возникает не только непрерывный спектр излучения, но появляются и отдельные линии излучения, положение которых определяется веществом анода. Механизм возникновения этих линий следующий.

Ускоренный электрон, выбивает один из внутренних электронов атома мишени (анода). На образовавшуюся вакансию перемещается электрон с одной из высших электронных оболочек атома. Возникающий при этом избыток энергии в атоме излучается в виде кванта электромагнитной волны. Частота этого кванта определяется разностью энергий между соответствующими энергетическими уровнями. Положение линий характеристического излучения определяется только строением атомов вещества мишени и не зависит от величины ускоряющей разности потенциалов между анодом и катодом. Последняя определяет интенсивность соответствующих линий в спектре.

Спектры характеристического излучения просты. Они классифицируются в порядке возрастания длин волн, величина которых зависит от типа оболочки атома из которой выбивается электрон (К-, L-, M- и т.д. Так, если электрон выбит с К-уровня, то в спектре характеристического излучения появятся линии К-серии, с L-уровня – L-серии и т.д.

Длина волны генерируемого в рентгеновских трубках электромагнитного излучения составляет 0,2 - 2Å. Эти значения соответствуют величинам мажатомных расстояний в молекулах. Следует сказать, что человек еще не умеет фокусировать рентгеновские лучи, не умеем создавать для них линзы. Поэтому ученые не могут построить микроскоп на основе рентгеновских лучей. По этой причине рентгеноструктурное исследование не позволяет получить непосредственное изображение объекта, а дает возможность создать дифракционную картину. Эта картина достаточно сложная даже для простых кристаллов. По мере увеличения числа атомов в элементарной ячейке, восстановление пространственной структуры объекта на основе дифракционной картины является весьма сложной задачей. Обычно эта задача решается на основе мощной вычислительной техники и надлежащего программного обеспечения.

 

Наряду с этим была определена конформация пептидных цепей, расположение различных химических групп, которые связываются с субстратом и т. д.

Таким образом, полученные новые данные явились значительным вкладом в понимание механизма катализа.

Исследования последнего времени были направлены на выяснения механизма биосинтеза ферментов в живых клетках.

У энзимологов распространен ряд специальных терминов, которые часто употребляются, необходимо разъяснить их значение. Термины эти "фермент", "субстрат", "активация", "активный центр", "кофермент" и "ингибитор".

В термин "фермент" различными учеными вкладывался различный смысл. Самым удачным, на наш взгляд" является определение, которое свидетельствует, что "это белок, который благодаря своей способности к специфическому активированию других веществ обладает каталитическими свойствами".

Вещества, на которые действуют ферменты и которые ими активируются называются субстратами ферментов.

Понятие "активация" существует не только в энзимологии, но и в химии. В ферментативных реакциях активация субстрата происходит путем образования фермент-субстратного комплекса. Согласно теории скоростей реакций Аррениуса активированными являются те молекулы, у которых запас кинетической энергии превышает какую-то определенную величину. В свою очередь фермент-субстратный комплекс представляет собой более стабильную структуру, нежели активированный комплекс. Хотя в процессе своего образования и распада проходит чере стадию активированных комплексов.

Изучение специфичности позволило установить, что субстрат соединяется не со всей молекулой фермента, а с отдельным ее участком, получившим название "активного центра".Первоначально предполагалось, что в каждой молекуле фермента имеется много активных центров. Однако, сейчас считается, что в большинстве случаев в молекуле фермента находится только один активный центр. Активный центр находится в углублении, поверхность которого комплементарна по форме субстрату. В этом углублении находится несколько групп, образующих водородные связи с определенными группами субстрата.

Во многих случаях для осуществления реакции помимо фермента и субстрата требуются дополнительные вещества. Эти вещества называются коферментами. Они составляют часть каталитической системы и остаются неизменными в конце реакции. Этим они отличаются от субстратов.

Часто наблюдается, что при добавлении определенных веществ, не принимающих участия в реакции, скорость реакции уменьшается. Такие вещества обычно называют "ингибиторами".Этот термин, однако, не принято относить к таким, например, веществам, как сильные кислоты, которые просто разрушают ферментный белок. Многие из ингибиторов действуют избирательно как яды для отдельных ферментов. Иногда в очень малых количествах. Изучение таких ингибиторов существенно обогатило наши знания о ферментах. Это нание имеет большое значение в токсикологии и фармакологии.

Перейдем к рассмотрению третьего вопроса "Современные представления о строении белков"

Ферменты представляют собой белковые вещества. Поэтому успехи в расшифровке структуры и механизма действия ферментов зависит в первую очередь от успехов в области исследования строения белков. Белки являются биополимерами с молекулярным весом от 6 тыс. до миллиона и более, состоящими из остатков аминокислот. В состав белков входят 20 различных аминокислот. Они в молекеуле белка связываются при помощи пептидной связи, установленной Эмилем Фишером. Он развил так называемую полипептидную теорию строения белка. Согласно этой теории аминокислоты соединяются между собой пептидной связью, которая образуется за счет водорода аминной группы одной аминокислоты и ОН группы карбоксила другой аминокислоты с выделением воды. Так, например, из аланина и глицина получается соединение, содержащее остатки двух аминокислот и называется дипептидом. Если присоединяется еще один остаток аминокислоты – получается трипептид и т. д.

Пептидная связь является основной связью в молекулах белка. Поэтому молекула белка представляет собой полипептидную цепочку. На одном конце ее находится аминогруппа, а на другом – свободная карбоксильная.

Последовательность отдельных аминокислотных остатков в полипептидной цепочке белка называется первичной структурой белковой молекулы. Свободная аминогруппа и свободная карбоксильная группа, находящиеся на концах полипептидной цепочки, называются концевыми группами. Концевая аминогруппа называется N-концевой, а концевая карбоксильная группа называется С-концевой аминокислотой.

Разработаны специальные методы, позволяющие определить концевые аминокислоты. Эти методы играют важную роль при изучении строения белков.

Рассмотрим несколько методов, позволяющих определить N – концевую аминокислоту. Одним из таких методов является метод Сенгера (Сенджера). Он заключается в следующем. Известно, что при кипячении белка с кислотой, он подвергается гидролизу, т. е. распадается на отдельные аминокислоты. Сенгер предложил перед гидролизом обрабатывать полипептидную цепь 2,4-динитрофторбензолом (ДНФ). Этот метод предложен в 1945 году. Оказалось, что свободная непротонированная аминогруппа N – концевой аминокислоты полипептида реагирует с ДНФ в щелочной среде с образованием окрашенных в желтый цвет 2,4-динитрофенильных производных (ДНФФ – производное аминокислоты). Это производное устойчиво в процессе кислотного гидролиза пептида и легко выделяется из смеси аминокислот по завершению расщепления. Структура N – концевой аминокислоты устанавливается по "метчику" или "свидетелю" при хроматографировании ДНФ – производных эталонны аминокислот. Первую стадии реакции проводят при температуре 25 – 37^оС, рН = 7 –8. Вторая стадия – обычный кислотный гидролиз белка (110⁰С, в среде 6 н НСl). Метод обладает ограниченной специфичностью. ДНФ реагирует не только с a-аминогруппой концевой аминокислоты, но и с e-аминогруппами лизина, SH – группами цистина, ОН – группами тирозина, имидазольными группами гистидина. Однако, e-ДНФ-лизин легко отличить с помощью специального свидетеля, а все остальные ДНФ-производные бесцветны и не мешают проведению анализа на N-концевую аминокислоту.

Второй метод определения N-концевых аминокислот – это метод, предложенный Греем и сотр в 1967 г. Этот метод носит название дансильного метода. Суть метода заключается в том, что аминогруппа реагирует с флуоресцентным красителем диметиламинонафталинсульфонилхлоридом (сокращенно дансилхлорид) в щелочной среде. Преимущества дансилирования по сравнению с динитрофенилированием заключается в том, что после кислотного гидролиза белка ДНС-аминокислоты могут быть сразу идентифицированы электрофоретическим или хроматографическим методом. Другое преимущество – это высокая чувствительность метода. Максимум флуоресценции ДНС-аминокислот находится около 550 на, их флуоресценция настолько интенсивна, что с помощью электрофореза на бумаге легко можно определить 1 – 5, а с помощью тонкослойной хроматографии 0,2 – 1,0 нмоль ДНС-производного.

Третий метод определения N-концевой аминокислоты – это метод Эдмана. Это более удобный метод определения N-концевой аминокислоты. В этом методе используется фенилизотиоционат (ФИТЦ)– реагент Эдмана. ФИТЦ реагирует с N-концевой аминокислотой пептида с образованием фенилтиокарбамоильного производного. При дальнейшей обработке кислотой происходит его циклизация с образованием фенилтиогидантоина N-концевой аминокислоты. В процессе циклиации эта аминокислота отщепляется от пептидной цепи. Вся остальная цепь пептида сохраняется неизменной, т. е. пептид сократился на одну аминокислоту. Многократное повторение реакции Эдмана можно изучить аминокислотную последовательность изучаемого белка. Следует сказать, что химическое расщепление коротких пептидов по Эдману является на сегодня единственным прямым методом секвенирования петидов. Однако, даже с помощью автоматического секвенатора, максимальное число операций (последовательного отщепления) по Эдману ограничено в настоящее время 20 – 40 аминокислотными остатками. Имеются сведения об успешном проведении операции секвенирования пептидов, состоящих из 40 – 60 аминокислотных остатков. Однако, полипептидные цепи многих белков значительно длиннее. Например a-цепь гемоглобина человека состоит из 141 аминокислотного остатка и др., такие длинные цепи нельзя проанализировать с помощью реакции Эдмана. В этом случае применяется следующий подход. Длинные полипептидные цепи расщепляются на отдельные небольшие фрагменты, которые затем выделяют и секвенируют по Эдману. Такое расщепление длинной цепи на фрагменты осуществляется с помощью ферментов, расщепляющих определенные пептидные связи или химических реагентов. Чаще всего для этой цели используют пищеварительные ферменты: трипсин, химотрипсин, пепсин и др. Эти ферменты расщепляют пептидные связи находящиеся внутри пептидной цепи. Поэтому эти ферменты называютэндопептидазамив отличие от ферментов, которые действуют на концевые аминокислоты и их называют экзопептидазами.

Иногда, для определения N – концевой аминокислоты используют аминопептидазы. На сегодня закончим нашу лекцию, а вопросы касающиеся определения С- концевой аминокислоты, первичная, вторичная, третичная и четвертичная структуры белков рассмотрим на следующей лекции.

Контрольные вопросы

1.В чем заключается значение ферментов для жизни организмов?

2.Кто и когда впервые выделил термостабильное вещество, которое превращала крахмал в сахар?

3.Как ранее назывались ферменты и к чему это привело?

4.Кем и что было предложено для того. Чтобы понимать о каком ферменте идет речь?

5.Назвать пищеварительные ферменты в которых окончание слова заканчивается на «ин».

6.Объяснить понятия, которые появились в науке ферментологии на раннем этапе ее развития – «организованные» и «неорганизованные» ферменты.

7.Какая заслуга Эмиля Фишера в изучении ферментологии?

8.Кем и когда были проведены работы по очистке фермента?

9.Кем и когда впервые получен фермент в кристаллическом виде?

10.В чем заключается заслуга в области энзимологии ученого Нортропа?

11.Назвать фундаментальные проблемы энзимологии.

12.С помощью какого метода была установлена трехмерная структура молекулы фермента?

13.Что такое активный центр фермента?

14.Что собой представляют коферменты?

15.Все ли вещества могут быть ингибиторами ферментов и какое значение эта проблема имеет для токсикологии и фармакологии?

16.Кто предложил пептидную теорию строения белка и как осуществляется связь одной аминокислоты с другой?

17.Описать метод Сенгера (сенджера), который применяется для определения N-концевой аминокислоты.

18.Описать дансильный метод определения N-концевой аминокислоты.

19.Описать метод Эдмана определения N-концевой аминокислоты.