Критерий чистоты ферментов

Лекция 3

Тема: ВЫДЕЛЕНИЕ ФЕРМЕНТОВ

План

Значение очистки ферментов. Методы очистки.

Методы фракционирования.

Критерий чистоты ферментов

Ферменты в клетках растительных и животных организмов находятся в виде сложных смесей. Число их измеряется сотнями. Чтобы изучить каждый отдельный фермент, его прежде всего нужно очистить. Если используют специфические методы определения активности ферментов, то можно исследовать и неочищенные ферменты. Так оно было и есть в действительности. Давайте вспомним определение активности пероксидазы, каталазы, полифенолоксидазы, амилазы и др. ферментов, все они определяются в неочищенных растительных экстрактах. Однако в ряде случаев примеси других ферментов мешают изучению выделяемого фермента. Иногда они действуют на субстрат и тогда появляются продукты побочных реакций, иногда действуют на продукт реакции, который превращается в какое-либо другое вещество, могут эти ферменты действовать на кофермент и даже на сам фермент, который выделяется. Поэтому до тех пор пока фермент не получен в чистом виде, трудно с уверенностью говорить, какую именно реакцию он катализирует.

Часто после очистки ферментов обнаруживают, что реакции казавшиеся простыми, на самом деле включают несколько отдельных этапов. Причем каждый из них катализируется отдельным ферментом. Это можно проиллюстрировать на примере гипотетических схем различных метаболических процессов, например, цикл лимонной кислоты. Механизм этого процесса стал ясным только тогда, когда удалось выделить фермент, катализирующий образование цитрата.

Для изучения свойств и поведения фермента как химического катализатора, необходимо иметь ферментный препарат высокой степени чистоты. Особенно это важно при исследовании специфичности фермента.

Окружающая фермент среда в пробирке сильно отличается от среды в клетке. Поэтому нельзя не принимать во внимание, что это отличие может влиять на поведение фермента. Очистка фермента может сказываться на его активности раличным образом. В ходе очистки фермента могут быть удалены какие-то кофакторы, необходимые для катализа. Зная какие это факторы их можно потом добавлять в реакционную среду. Иногда свойства фермента меняются под влиянием операций очистки. Особенно в тех случаях, где приходится нагревать фермент. Чувствительные к этой операции регуляторные ферменты. Так, например, некоторые свойства сукцинатдегидрогеназы меняются при переводе ее в раствор.

Методы очистки.

Предположим, что открыт какой-то новый фермент и что нам предстоит выделить его в чистом виде.

Первое, что необходимо сделать перед тем, как приступить к работе по очистке данного фермента – это подобрать количественный тест для определения его активности. Трудность в разработке теста состоит в том, что система может оказаться более сложной, чем нами предполагалось. Допустим, что в процессе ферментативной реакции субстрат А превращается в вещество В и тест основан на определении вещества В. В действительности может оказаться, что превращение вещества А идет с образованием незамеченного нами продукта С, а это свидетельствует о том, что в процесс вовлечены два фермента. Первый превращает субстрат А в С, а другой – С в В. В таком случае на той стадии очистки, на которой эти два фермента разделяются, обнаружится общее уменьшение активности при использовании данного теста. Следовательно, данный тест должен быть заменен тестом, который позволяет определить продукт С.

Аналогичная картина наблюдается, когда в реакции, катализируемой простым ферментом участвует кофермент, о присутствии которого в данной системе мы не предполагали. И в этом случае активность фермента при его очистке исчезает. Если удаленный фактор окажется одним из известных коферментов, то его можно просто добавить в пробы. Если же природа кофермента неизвестна, то активность фермента может быть восстановлена путем добавления к нему либо прокипяченного тканевого экстракта (коферменты относительно термоустойчивы), либо диализата (молекулы большинства коферментов невелики и проходят сквозь поры мембраны).

Ферменты в клетке присутствуют в небольших количествах, составляющих от 1/10 до 1/10000 части всего материала клетки. Поэтому необходимо иметь выбранную единицу фермента с помощью которой можно было бы количественно выразить чистоту и активность различных фракций. В большинстве случаев выбор единицы зависит от избираемого метода определения фермента. Если это спектрофотометрический метод, то такой единицей может служить количество фермента, которое вызывает определенное изменение оптической плотности за определенной период времени при данных условиях опыта. Если определяется продукт реакции, то единицей будет количество фермента, которое вызывает образование определенного количества вещества в минуту. Желательно выбирать такую единицу, которая насколько это возможно соответствовала рекомендациям Комиссии по ферментам.

Когда выбрана единица фермента, другие показатели могут быть выражены с помощью этой же единицы. Например, концентрацию фермента в растворе выражают числом единиц в 1 мл. Удельную активность фермента выражают числом единиц в 1 мг вещества. Согласно рекомендации Комиссии по ферментам удельную активность ферментов следует выражать числом единиц в 1 мг белка. Количество белка можно определять различными методами. Классическим методом является определение общего азота по Кьельдалю. Обычно белки содержат 15 – 16% азота. Однако, вклад в эту величину могут вносить азотсодержащие вещества небелковой природы. Особенно этот метод непригоден в том случае, когда приходится осаждать белки сульфатом аммония. Правда, можно удалить небелковый азот с помощью соответствующих методов (диализ, гель-фильтрация), но эта процедура еще больше замедлит определение белка. Для измерения количества белка используют колориметрические методы, основанные на биуретовой реакции, которая реагирует на пептидные связи. Метод Фолина и Чиокальто основан на хромогенной природе некоторых боковых групп аминокислот, а также на присутствии в белках пептидных связей. Этот метод обладает высокой чувствительностью (на пробу достаточно 0,01 – 0,1 мг белка), но многие небелковые вещества мешают определению белка, например фенольные вещества.

В настоящее время для определения количества белка пользуются измерением интенсивности поглощения света при 280 нм, которое обусловлено присутствием в белке ароматических аминокислот. Количество этих аминокислот в разных белках различно. Поэтому интенсивность поглощения света у этих белков неодинакова.

Экстракция.

После того как определен объект исследования, фермент необходимо перевести в раствор. Для этого требуется разрушить клеточную оболочку. Из животных тканей экстрагировать ферменты легче, чем из микроорганизмов. Часто для извлечения ферментов из измельченной мышцы или печени достаточно простая экстракция водой. В целях более полной экстракции фермента необходимо тщательно измельчить ткань при помощи гомогенизатора.

Один из простых приемов экстракции является растирание ткани с песком или измельченным стеклом, замораживание и оттаивание, обработка растворителями (ацетон).

Экстракция ферментов из субклеточных органелл представляет особую проблему. До недавнего времени считалось, что ферменты митохондрий нерастворимы и неотделимы от их самих. Работы, проводимые исследователями в этом плане увенчались успехом. Сейчас известно, что провести экстракцию ферментов из митохондрий возможно при повреждении мембран михондрий. Однако некоторые ферменты митохондрий экстрагировать очень трудно. Для этого используют специальные методы, например, высушивание ацетоном, обработка материала смесью бутанола с водой, экстракция водными растворами детергентов, таких как холат, дезоксихолат, твин, тритон, эмазол и др. Считается, что при обработке ткани (митохондрий) бутанолом происходит разрушение липопротеидного комплекса в результате чего фермент переходит в водную фазу. Обработка детергентом используется при выделении компонентов дыхательной цепи, которая приводит к истинному растворению фермента. После удаления детергента остается фермент в виде прозрачного раствора.

Перейдем к рассмотрению второго вопроса "Методы фракционирования"