Лекция 3. Разделение белков путем осаждения

Осаждение нуклеиновых кислот.

Обычно, когда говорят о высаливании, имеют в виду высаливание именно сульфатом аммония. Этому методу уже более 130 лет. Раньше он применялся и для фракционирования, сейчас, в основном, как дешёвый и удобный метод осаждения белков. Можно считать, что повезло, если при этом получается ещё и существенная очистка (при высаливании из клеточного экстракта можно рассчитывать на приблизительно 2-10 кратное обогащение).

Почему именно сульфат аммония?

При равной молярной концентрации поливалентные анионы долее эффективны для высаливания, чем моновалентные (отчасти из-за того, что имеет значение не концентрация соли, а ионная сила раствора), а поливалентные катионы даже препятствуют действию поливалентных анионов. Получается, что оптимально сочетание - это поливалентный анион с моновалентными катионами.

Эффективность высаливания убывает в серии Гофмейстера (Hofmeister):

Цитрат > Сульфат > Фосфат > Хлорид > Нитрат > Тиоционат

В этом же ряду убывает стабилизирующий эффект и возрастают хаотропные свойства соли. Таким образом, наиболее подходящие кандидаты: цитрат и сульфат. Сульфат более удобен из-за лучшей растворимости (например, при нормальной температуре растворимость аммонийных солей цитрата и сульфата равны примерно 2.5М и 4.1М); низкой цены и стабилизирующего влияния, которое он оказывает на большинство белков при концентрациях выше 0.5М.

(NH4) 2SO4 преципитируют белки по двум механизмам

сульфат-ионы делают молекулу белка более компактной (менее растворимой) за счёт взаимодействия с положительно заряженными аминокислотами. Это взаимодействие более эффеективно при pH<pI.

обезвоживание. Один ион SO42 - имеет 13-14 молекул H2O только в первом гидратном слое и, возможно, больше - во втором. Если одна молекула сульфата координирует даже 15 молекул H2O, то 3M сульфат аммония связывает 45 из имеющихся в воде 55M молекул H2O.

Ионная сила раствора

I = 1/2 ci (zi) 2,

где:

ci - концентрация иона; zi - заряд иона.

Например, для 1M NaCl: I = 1/2 (1 (1) 2 + 1 (1) 2) = 1 для 1M (NH4) 2SO4: I = 1/2 (2 (1) 2 + 1 (1) 2) = 3

Растворимость белков

Влияние ионной силы и температуры При низкой ионной силе (<0.2M) растворимость белка увеличивается при повышении концентрации соли, так как экранирование притяжения противоположно заряженных групп приводит к разрыхлению структуры белка. При высокой ионной силе (>0.2M) - растворимость белка понижается из за высаливания и обезвоживания. Она падает экспоненциально с повышением ионной силы: logS = ß - KsI, где:

S [g/l] - растворимость белка; I - ионная сила; ß; Ks - константы.

Ks - слегка различается для различных белков и почти не зависит от pH и температуры. ß - сильно зависит от белка, pH и температуры; повышение температуры вызывает понижение ß => уменьшение растворимости белка.

Влияние pH. При низкой ионной силе (<0.2M) растворимость белка минимальна при pH равном изоэлектрической точке белка. При высоких концентрациях (NH4) 2SO4 растворимость повышается с повышением pH, так как при низких pH сульфат ион компактизует белок взаимодействуя с положительно заряженными группами. Так что лучше проводить осаждение при pH<pI.

Влияние начальной концентрации белка Белки бывают двух типов. Для типа I растворимость не зависит от исходной концентрации белка; для типа II - зависит сильно.

Ограничения метода.

Высокая концентрация ионов аммония в осадке может мешать точному определению концентрации белка.

Высаливаются не только белки, но и, например, детергенты. Например, 0.5% Tween 20 и Triton X100 начинают агрегировать при концентрациях сульфата аммония больше 1M. Образующийся преципитат имеет плотность чуть меньше плотности солевого раствора. При центрифугировании он всплывает, прихватывая с собой белки.

Осаждение сульфатом амония нельзя использовать для белков, требующих присутствия Ca2+ из-за нерастворимости сульфата кальция.