Определение ддт, ддэ, ддд, альдрина, дильдрина, гептахлора, кельтана, метоксихлора, эфирсульфоната и других ядохимикатов в продуктах питания хроматографией в тонком слое

Принцип метода. Метод основан на извлечении препаратов из пробы органическими растворителями (н-гексан, петролейный эфир, диэтиловый эфир, хлороформ), очистке экстракта и последующем хроматографировании в тонком слое окиси алюминия или силикагеля. Подвижным растворителем служит нормальный гексан или гексан в смеси с ацетоном. Места локализации препаратов обнаруживают после опрыскивания пластинок раствором аммиаката серебра в ацетоне или 2%-ным раствором дифениламина с последующим ультрафиолетовым облучением. Количественное определение проводится путем визуального сравнения или измерения площадей пятен проб и стандартных растворов. [5]

Минимально детектируемое количество при проявлении азотнокислым серебром 0,5 мкг, при проявлении дифениламином 10 мкг. Чувствительность определения в воде и вине 0,002 мг/л, яблоках и капусте 0,02, в других овощах и фруктах 0,01, зерне 0,05, сене 0,05, рыбе, мясе, внутренних органах, жире 0,02, молоке, твороге 0,01, почве 0,01 мг/кг. Полнота определения 90±5%.

Реактивы и растворы: Гексан «х. ч.», петролейный эфир (t_кип. 40—70^еС), диэтиловый эфир для наркоза, хлороформ х. ч., бензол х. ч., ацетон х. ч., натрий сернокислый безводный х. ч., насыщенный раствор безводного сернокислого натрия в серной кислоте плотностью 1,84 г/см³ (100 г безводного сернокислого натрия растворяют в 1л серной кислоты), окись алюминия для хроматографии или силикагель КСК, просеянные через сито 100 меш., кальций сернокислый (CaSO₄×2H₂O) «ч. д. а.» - просушивают в сушильном шкафу 6 ч при 150—160° С и хранят а банке с притертой пробкой; спирт этиловый.

Проявляющий реактив №1. 0,5 г азотнокислого серебра растворяют в 5 мл дистиллированной воды, прибавляют 7 мл аммиака плотностью 0,9 г/см³ и доводят объем раствора до 100 мл ацетоном. Готовят в день употребления. На пластинку 9 ´ 12 см расходуется 8—10 мл раствора.

Проявляющий реактив №2. 2%-й раствор дифениламина в ацетоне. 5%-ный водный раствор оксалата калия ч. д. а.Насыщенный водный раствор натрия хлористого. Силикагель АСК Воскресенского химкомбината (Московская обл.). Стандартные растворы пестицидов (100—200 мкг/мл). 10—20 мг ДДТ х. ч. или др. пестицида растворяют в 100 мл гексана, хранят в холодильнике в плотно закрытой склянке. Пластинки для хроматографии. Тщательно промытую содой, хромовой смесью, дистиллированной водой, высушенную стеклянную пластинку 9 ´ 12 или 13 ´ 18 см протирают этиловым спиртом или эфиром и покрывают сорбционной массой. Массу готовят следующим образом: 50 г просеянной через сито 100 меш окиси алюминия смешивают в фарфоровой ступке с 5 г сернокислого кальция, прибавляют 75 мл дистиллированной воды и перемешивают в ступке или колбе до образования однородной массы. 10 г сорбционной массы равномерно распределяют по всей поверхности пластинки 9 ´ 12 см путем ее покачивания. Сушат пластинки при комнатной температуре 18—20 ч и хранят в эксикаторе.

Сорбционную массу можно приготовить из силикагеля (35 г силикагеля, 2 г гипса и 90 мл дистиллированной воды). Силикагель предварительно очищают от примесей, - заливают на 18—20 ч. разбавленной соляной кислотой (1 : 1), кислоту сливают, промывают силикагель водой и кипятят 2—3 ч с разбавленной азотной кислотой (1 : 1), промывают проточной водопроводной, затем дистиллированной содой до нейтральной реакции промывных вод, сушат в сушильном шкафу 4—6 ч при температуре 130° С. Силикагель дробят и просеивают через сито 100 меш, хранят в склянке с притертой пробкой.

Делительные воронки на 100, 250 и 500 мл.

Мерные колбы на 100 мл.

Колбы с притертыми пробками на 250 и 500 мл.

Прибор для отгонки растворителей.

Колбы круглодонные на 50 и 100 мл.

Пульверизаторы стеклянные для опрыскивания пластинок (рис. 1).

Камера для хроматографирования. Стеклянный сосуд с притертой крышкой. Можно использовать эксикатор.

Камера для опрыскивания.

Микропипетки для нанесения стандартных растворов.

Пипетки или шприцы для нанесения проб.

Бани водяные.

Ртутно-кварцевая лампа.

Хроматографические колонки 18 ´ 390 мм.

Ход анализа

Пищевые продукты и корма. Для анализа из средней пробы отбирают: овощи, фрукты, грибы, зерно, творог — 500 г, сыр— 100, мясо, рыба — 250, масло сливочное, сливки — 200, трава — 200, сухие грибы, сено — 50 г, вино, вода, молоко — 500 мл. Масло растапливают, овощи, фрукты и т.п. измельчают и тщательно перемешивают.

Вода, вино. Пробы отбирают только в стеклянную посуду. 200—300 мл пробы в колбе с притертой пробкой экстрагируют в течение 15 мин на приборе для встряхивания н-гексаном или петролейным эфиром тремя порциями по 30 мл или диэтиловым эфиром тремя порциями по 40—50 мл. Экстракцию можно проводить в делительных воронках, энергично встряхивая жидкость 3 раза по 3—5 мин.

В объединенные экстракты насыпают около 10 г безводного сернокислого натрия или объединенные экстракты фильтруют через воронку с сернокислым натрием. Экстракты переносят в прибор для отгонки растворителей, отгоняют растворитель до небольшого объема (0,1—0,2 мл).

Овощи, фрукты. 10г измельченной пробы трижды экстрагируют в течение 15 мин на аппарате для встряхивания н-гексаном или петролейным эфиром тремя порциями по 30 мл. Объединенные экстракты сушат безводным сернокислым натрием, переносят в прибор для отгонки растворителей, отгоняют растворитель до небольшого объема.

Зерно, грибы. 10 г зерна, 50 г сырых или 10 г сухих грибов мелко измельчают и экстрагируют па приборе для встряхивания н-гексаном или петролейным эфиром порциями по 30 мл. Объединенные экстракты переносят в делительную воронку, прибавляют 10 мл насыщенного раствора безводного сернокислого натрия в серной кислоте и осторожно встряхивают несколько раз. Отделяют органический слой и повторяют обработку до тех пор, пока кислота не станет бесцветной. Сушат экстракт над безводным сернокислым натрием, отгоняют растворитель до небольшого объема.

Яблоки, капуста, трава, сено. 10 г пробы яблок, 10— 20 г капусты, 10—20 г травы или 5—10 г сена измельчают, заливают 100 мл ацетона. Встряхивают 2—3 мин, прибавляют 20 мл ледяной дистиллированной воды и охлаждают на льду 30 мин. Экстракт сливают и фильтруют холодным, экстракцию повторяют. Из объединенных водно-ацетоновых экстрактов отгоняют ацетон, а из водного слоя экстрагируют препарат н-гексаном или петролейным эфиром тремя порциями по 10 мл в течение 10 мин. Гексановые экстракты очищают серной кислотой, насыщенной безводным сернокислым натрием. Сушат безводным сернокислым натрием. Отгоняют растворитель до небольшого объема и наносят на пластинку. Если очистка неполная, экстракт испаряют досуха, остаток промывают холодным ацетоном 3 раза порциями по 0,2 мл и сразу наносят на пластинку.

Рыба, мясо. Мясо пропускают через мясорубку. Рыбу очищают от чешуи, внутренних органов и пропускают через мясорубку. 25 г пробы заливают 40 мл н-гексана или петролейного эфира, взбалтывают 2 мин, разбивают образовавшиеся комочки и оставляют на 30 мин. Экстракцию повторяют дважды. Объединенные экстракты переносят в делительную воронку, добавляют 10 мл насыщенного раствора сернокислого натрия в серной кислоте и осторожно встряхивают несколько раз. Отделяют органический слой. Обработку повторяют до тех пор, пока кислота не станет бесцветной. Сушат экстракты безводным сернокислым натрием, растворитель испаряют до 0,1 мл.

Внутренние органы, животный жир. 25 г измельченной пробы помещают в колбу и заливают концентрированной серной кислотой, насыщенной безводным сернокислым натрием (проба должна полностью находиться в кислоте). Содержимое колбы перемешивают стеклянной палочкой, прибавляют 40 мл н-гексана, непрерывно встряхивают 2 мин, периодически встряхивают в течение 30 мин. Экстракт декантируют, экстракцию повторяют. Слитые в делительную воронку экстракты осторожно встряхивают с концентрированной серной кислотой, насыщенной сернокислым натрием. Операцию повторяют несколько раз до получения бесцветного раствора серной кислоты. Отделяют гексановый слой, сушат безводным сернокислым натрием и испаряют.

Растительные масла. 10 мл масла наливают в делительную воронку, прибавляют 20 мл ацетона, встряхивают и приливают 10 мл этилового спирта. Выделившееся масло сливают. К ацетоно-спиртовому экстракту прибавляют 100 мл 2%-ного водного раствора сернокислого натрия. Из смеси экстрагируют препарат 2 раза н-гексаном порциями по 30 мл, каждый раз встряхивая 5 мин. К объединенным гексановым экстрактам прибавляют 20 мл насыщенного раствора безводного сернокислого натрия в серной кислоте и осторожно встряхивают несколько раз. Отделяют органический слой и повторяют обработку до тех пор, пока кислота не обесцветится. Сушат экстракт и испаряют растворитель до 0,1—0,2 мл.

Молоко, сливки. К 50 мл молока или 20г сливок прибавляют концентрированную серную кислоту (30—40 мл) до полного почернения пробы. Охлажденный до 10—15° С раствор переносят в делительную воронку и экстрагируют н-гексаном 2 раза порциями по 25 мл. Для полного извлечения воронку встряхивают 2 мин, затем оставляют ее на несколько минут до полного разделения слоев. Если образуется эмульсия, прибавляют 1—2 мл этилового спирта. К объединенным экстрактам в делительной воронке прибавляют 10 мл концентрированной серной кислоты, насыщенной сернокислым натрием, и осторожно встряхивают несколько раз. Очистку повторяют до получения бесцветной кислоты.

Творог, сыр. 50 г творога или 10 г измельченного на терке сыра заливают 40 мл н-гексана или петролейного эфира, непрерывно встряхивают 2—3 мин и периодически встряхивают в течение 30 мин. Экстракцию повторяют. Объединенные экстракты в делительной воронке очищают серной кислотой, как указано выше.

Сливочное масло. 20 г сливочного масла растапливают на водяной бане в круглодонной колбе, прибавляют 50 мл ацетона, тщательно перемешивают до растворения жира, прибавляют 10 мл ледяной дистиллированной воды и охлаждают па льду до затвердения жира (примерно 30 мин). Сливают ацетоновый экстракт процедуру повторяют 3 раза. Из объединенных экстрактов в круглодонной колбе ацетон отгоняют на водяной бане. Пестициды экстрагируют из оставшегося водного экстракта гексаном тремя порциями по 10 мл в течение 5 мин. Объединенные гексановые экстракты в делительной воронке обрабатывают серной кислотой с сернокислым натрием. Очищенный экстракт сушат и упаривают. Второй способ подготовки проб молока и молочных продуктов. Молоко (кефир, простокваша, кумыс и другие цельномолочные продукты). 25 мл продукта помещают в делительную воронку на 300 мл, приливают по 5 мл раствора оксалата калия и насыщенного раствора NaCl, перемешивают, приливают 100 мл ацетона, встряхивают 2 мин. Приливают 100 мл хлороформа и встряхивают 2 мин. Воронку оставляют до полного разделения слоев. Верхнюю фазу отбрасывают, а нижнюю выливают в круглодонную колбу со шлифом и испаряют растворитель досуха. Остаток смывают 30 мл гексана.

Сгущенное молоко. 10—20%-ные сливки. К 10 г продукта прибавляют 10 мл насыщенного раствора NaCI и выливают в делительную воронку вместимостью 150 мл. К смеси приливают 40 мл ацетона, встряхивают 2 мин, приливают 60 мл хлороформа, встряхивают 2—3 мин и оставляют до разделения фаз. Далее поступают, как при определении пестицидов в молоке.

Сгущенные молочные продукты. 10 г продукта помещают в стаканчик, заливают 10 мл воды с температурой 45—50° С, перемешивают и переносят в делительную воронку емкостью 150 мл, добавляют 5 мл раствора оксалата калия. Содержимое воронки перемешивают, приливают 80 мл ацетона и встряхивают 2—3 мин, добавляют 100 мл хлороформа и встряхивают 5—7 мин. После разделения фаз нижнюю фазу сливают в круглодонную колбу, растворители отгоняют, а остаток растворяют в 30 мл петролейного эфира.

Сухие молочные продукты. 3 г сухих молочных продуктов (2 г сухих сливок) высыпают в стаканчик, приливают 15 мл дистиллированной воды с температурой 40—45° С, размешивают и переносят в делительную воронку вместимостью 300 мл, приливают по 5 мл раствора оксалата калия и насыщенного раствора поваренной соли. Содержимое воронки перемешивают, добавляют 80 мл ацетона и встряхивают 3—5 мин, приливают 100 мл хлороформа, встряхивают 5 мин и оставляют на 3—5 мин (до разделения фаз). Нижнюю фазу сливают в колбу, растворители отгоняют, а остаток смывают 30 мл н-гексана.

Масло, молочный жир. 2 г продукта высыпают в стаканчик, подогревают до 40° С и растворяют в 30 мл н-гексана.

Сметана, 30—40%-ные сливки. 5 г продукта отвешивают в стаканчик, добавляют 10 мл насыщенного раствора поваренной соли и переносят в делительную воронку вместимостью 150 мл. Стаканчик обмывают 40 мл ацетона, смывы переносят в делительную воронку, которую встряхивают 1—2 мин, добавляют 70 мл хлороформа и встряхивают 2—3 мин. Воронку оставляют на 3—5 мин (до разделения фаз), нижнюю фазу слипают в колбу для отгонки растворителей, растворители отгоняют, а остаток смывают 30 мл л-гексана.

Творог, сыр. 10 г творога или измельченного на терке сыра растирают с 10 мл насыщенного раствора поваренной соли и переносят в делительную воронку на 250—300 мл. Прибавляют 80 мл ацетона, встряхивают 2 мин, прибавляют 100 мл хлороформа и вновь встряхивают. Нижнюю фазу используют для анализа после отгонки растворителей, растворив остаток в 30 мл н-гексана.

Очистка экстракта от молочного жира. В нижнюю часть хроматографической колонки помещают стекловату, затем насыпают в колонку 70 мл силикагеля АСК и уплотняют его постукиванием. Колонку промывают 50 мл гексана, а прошедший через нее растворитель отбрасывают. На подготовленную таким образом колонку наносят 30 мл полученного из молока или молочных продуктов экстракта. После впитывания экстракта в сорбент пестицид элюируют 110мл смеси бензола с гексаном (3:8) порциями по 25—30 мл. Элюат собирают в круглодонную колбу со шлифом вместимостью 250—300 мл. Через 10 мин после впитывания последней порции растворителя сорбент отжимают с помощью резиновой груши. После очистки растворители отгоняют под вакуумом.

Хроматографирование. На хроматографическую пластинку на расстоянии 1,5 см от ее края шприцем или пипеткой наносят исследуемую пробу в одну точку так, чтобы диаметр пятна не превышал 1 см.

Остаток экстракта в колбочке смывают тремя небольшими порциями (по 0,2 мл) диэтилового эфира, которые наносят в центр первого пятна. Справа и слева от пробы на расстоянии 2 см наносят стандартные растворы, содержащие 1,5 и 10 мкг исследуемых препаратов. Для нанесения 1 мкг стандартный раствор следует разбавлять в 10 раз.

Пластинку с нанесенными растворами помещают в камеру для хроматографирования, на дно которой за 30 мин до начала хроматографирования наливают подвижный растворитель н-гексан, а для препаратов, у которых R_f в гексане ниже 0,3 — смесь гексана с ацетоном (6:1). Край пластинки с нанесенными растворами может быть погружен в подвижный растворитель не более чем на 0,5 см.

После того как фронт растворителя поднимется на 10 см, пластинку вынимают из камеры и оставляют на несколько минут для испарения растворителя. Далее пластинку орошают проявляющим реактивом и подвергают УФ-облучению 10—15 мин (лампа ПРК-4). Пластинки следует располагать на расстоянии 20 см от источника света.

При наличии хлорорганических пестицидов на пластинке появляются пятна серо-черного цвета. Количественное определение осуществляют сравнением размеров пятен пробы и стандартного раствора (визуально или измеряют площади). Между количеством препарата в пробе, не превышающем 20 мкг, и площадью его пятна на пластинке существует прямая пропорциональность. При большем содержании препарата следует использовать пропорциональную часть исследуемого экстракта.

Расчет количества препарата в пробе вычисляют по формуле:

X = A / P или

где X — содержание препарата в пробе, мг/кг или мг/л; А — количество препарата, найденное путем визуального сравнения со стандартным раствором, мкг; Р — масса или объем исследуемой пробы, г или мл; А₁ – содержание препарата в стандартном растворе, мкг; S₁ – площадь пятна стандартного раствора, мм²; S – площадь пятна пробы, мм².

Величина R_f зависит от адсорбента, размера его частиц, количества и природы связующего материала, толщины слоя, природы подвижного растворителя, степени насыщения камеры для хроматографирования парами подвижного растворителя, расстояния пройденного растворителем, температуры, количества и природы коэкстрактивных веществ.

Для ДДТ R_f для оксида алюминия составляет 0,61-0,71 (в зависимости от изомера) и 0,50-0,54 на силикагеле.

На слое оксида алюминия обнаруживаются три пятна, которые соответствуют 4,4'-ДДТ (основное пятно), 2,4'-ДДТ и 4,4'-ДДД (слабое пятно). Пятно ДДД проявляется, если содержание ДДТ в анализируемой пробе превышает 20 мкг. Содержание изомеров ДДТ суммируют. На хроматограммах проб пищевых продуктов, содержащих остаточные количества ДДТ, кроме упомянутых трех пятен, обнаруживается четвертое пятно, соответствующее продукту разложения ДДТ — ДДЭ.

На слое силикагеля технический препарат ДДТ дает одно пятно, соответствующее сумме изомеров. Если количество ДДТ в пробе превышает 20 мкг, на хроматограмме появляется слабое пятно, соответствующее ДДД. [5]