Использование сорбентов на основе силикагеля в хроматографических методах анализа

Хроматография - это метод разделения компонентов смеси, основанный на различии в равновесном распределении их между двумя несмешивающимися фазами, одна из которых неподвижна, а другая подвижна. Чем сильнее сродство компонента к неподвижной фазе, тем сильнее он сорбируется и дольше задерживается на сорбенте; тем медленнее его продвижение вместе с подвижной фазой. Поскольку компоненты смеси обладают разным сродством к сорбенту, при перемещении смеси вдоль сорбента произойдет разделение: одни компоненты задержатся в начале пути, другие продвинутся дальше. В хроматографическом процессе сочетаются термодинамический (установление равновесия между фазами) и кинетический (движение компонентов с разной скоростью) аспекты.

Различные методы хроматографии можно классифицировать по агрегатному состоянию фаз, механизму разделения, аппаратурному оформлению процесса (по форме) и по способу перемещения подвижной фазы и хроматографируемой смеси [13].

По агрегатному состоянию фаз различаютжидкостную и газовую хроматографию.

По технике выполнения хроматографию подразделяют на колоночную (разделение веществ проводится в специальных колонках) и плоскостную: тонкослойную и бумажную. В тонкослойной хроматографии разделение проводится в тонком слое сорбента, в бумажной - на специальной бумаге.

Хроматография как метод была открыта в 1903 г. русским ученым-ботаником М.С. Цветом, который использовал для разделения растительных пигментов на их составляющие колонки, заполненные порошком мела [14]. При вымывании пигментов петролейным эфиром они перемещались вдоль колонки, разделяясь при этом на кольца разного цвета. Метод оказался очень удобным и был позднее назван Цветом хроматографией (цветописью).

Отправной точкой бурного развития многих методов хроматографического анализа является работа лауреатов Нобелевской премии A. Мартина и Р. Синджа. Ими был предложен и разработан метод распределительной хроматографии (1941 г.). В 1952 г. А. Мартином и Л. Джеймсом были получены первые результаты в области газожидкостной хроматографии. Эти работы вызвали огромное число исследований, направленных на развитие метода газовой хроматографии.

За короткое время были усовершенствованы конструкции систем ввода проб, созданы чувствительные детекторы. Метод газовой хроматографии - первый из хроматографических методов, получивших инструментальное обеспечение. Если в 50-е и 60-е годы методы хроматографии в тонких слоях (бумажная и тонкослойная) в значительной мере заменили колоночную как более быстрые, удобные и простые, то 70-е годы характеризуются гигантским прогрессом именно высокоэффективной (инструментальной) жидкостной хроматографии, где для ускорения процесса хроматографирование проводят под давлением.

ВЭЖХ в настоящее время не только в большой мере вытеснила классическую колоночную, бумажную и тонкослойную хроматографию (далее по тексту ТСХ), но и обогнала газовую хроматографию по темпам развития. Быстрый рост применения ВЭЖХ связан с освоением и серийным выпуском как отдельных узлов (насосов, инжекторов, детекторов), так и комплектных жидкостных хроматографов. Немалую роль сыграли также разработка теоретических основ ВЭЖХ, организация выпуска высокочистых растворителей и химикатов для ВЭЖХ. Особенно следует отметить организацию выпуска узкодисперсных сорбентов зернением от 3 до 10 мкм на основе силикагеля, в том числе и с химически привитыми неподвижными фазами, и разработку способов заполнения ими высокоэффективных колонок для ВЭЖХ [15].

Причин быстрого развития ВЭЖХ несколько. Прежде всего, следует назвать большой диапазон молекулярных масс веществ, с которыми можно работать: от нескольких единиц до десятков миллионов, что существенно шире, чем в газовой хроматографии. Кроме того, мягкость условий ВЭЖХ (почти все разделения можно проводить при температурах, близких к комнатной, при отсутствии контакта с воздухом) делает ее особенно пригодным, а зачастую единственным методом исследования лабильных соединений, в частности, биологически активных веществ и биополимеров [17].

Среди разнообразных методов анализа ВЭЖХ отличается самой высокой степенью информативности благодаря одновременной реализации функций разделения, идентификации и определения; избирательностью; низким пределом обнаружения, а также возможностью автоматизации и компьютеризации процесса разделения, обнаружения и количественного определения. Хроматографический метод анализа универсален и применим к разнообразным объектам исследования (нефть, лекарственные препараты, вещества растительного и животного происхождения, биологические жидкости, пищевые продукты и др.) [17].

По механизму разделения анализируемых или разделяемых веществ ВЭЖХ делится на: адсорбционную; распределительную; ионообменную; эксклюзионную [17].

В адсорбционной хроматографии разделение веществ, входящих в смесь и движущихся по колонке в потоке растворителя, происходит за счет их различной способности адсорбироваться и десорбироваться на поверхности адсорбента с развитой поверхностью [17, 18].

В распределительной ВЭЖХ разделение происходит за счет разной растворимости разделяемых веществ в неподвижной фазе, как правило, химически привитой (модифицированной) к поверхности неподвижного носителя, и подвижной фазе растворителе. Этот метод разделения наиболее популярен, особенно в случае, когда привитая фаза представляет собой неполярный алкильный остаток от C₈ до C₁₈, а подвижная фаза более полярна, например смесь метанола или ацетонитрила с водой. Этим вариантом, так называемой обращенно-фазной (или обратно-фазной, или с обращением фаз) хроматографии в настоящее время проводят около двух третей разделений в ВЭЖХ. Термин «обращенно-фазная ВЭЖХ» произошел от обратного, по сравнению с таковым в классическом адсорбционном варианте, соотношения полярности сорбента и растворителя: полярный сорбент и неполярная подвижная фаза для адсорбционной и, наоборот, неполярный сорбент и полярная подвижная фаза для обращенно-фазного варианта распределительной хроматографии [17].

В ионообменной хроматографии молекулы веществ смеси, диссоциировавшие на катионы и анионы в растворе, разделяются при движении через сорбент, на поверхности которого привиты катионные или анионные центры, способные к обмену с ионами анализируемых веществ за счет их разной скорости обмена [19].

В эксклюзионной (ситовой, гель-проникающей, гель-фильтрационной) хроматографии молекулы веществ разделяются по размеру за счет их разной способности проникать в поры носителя. При этом первыми выходят из колонки наиболее крупные молекулы (наибольшей молекулярной массы), способные проникать в минимальное число пор носителя. Последними выходят вещества с малыми размерами молекул, свободно проникающие в поры сорбента [17].

Большинство проводимых методом ВЭЖХ разделений основано на смешанном механизме взаимодействия веществ с сорбентом, обеспечивающим большее или меньшее удерживание компонентов в колонке.

Сорбенты, используемые для ВЭЖХ, делят на несколько групп, каждая из которых, в свою очередь, подразделяется на типы. Общепринятым является разделение сорбентов на группы по химической природе матрицы (основы) сорбента, а по типам - по методу химической обработки матрицы, делающей ее пригодной для использования в определенном виде хроматографии.

Основными группами сорбентов являются: 1) поверхностно-пористые сорбенты, представляющие собой непроницаемое для растворителя твердое ядро из стекла, на поверхность которого занесен тонкий слой пористого абсорбента, обычно силикагеля; 2) пористые сорбенты на основе силикагеля; 3) пористые сорбенты на основе оксида алюминия; 4) пористые сорбенты на полимерной основе.

Сорбенты первой группы были исторически первыми, стимулировавшими быстрый рост ВЭЖХ. Они представляют собой стеклянные микрошарики размером 35-50 мкм, на поверхности которых различными способами закрепляется слой силикагеля или оксида алюминия толщиной в 1-2 мкм. Наряду с достоинствами поверхностно-пористых сорбентов (возможность упаковки в колонки сухим способом, легкость фракционирования, широкий ассортимент привитых и нанесенных фаз) обнаружились их серьезные недостатки. Главными следует считать малую емкость по пробе, связанную с малой поверхностью сорбента в колонке (основной объем сорбента занимает непористое ядро, не участвующее в разделении), большое гидравлическое сопротивление длинных колонок, их малую производительность, сложную технологию получения сорбентов и их высокую цену, недостаточную эффективность колонок и длительность анализа [15].

В настоящее время поверхностно-пористые сорбенты практически не используют для аналитической работы. Единственная область применения, которая для них сейчас осталась, это использование в предколонках. Предколонки устанавливают перед аналитической колонкой для улавливания необратимо сорбируемых загрязнений из проб.

Дальнейшее быстрое развитие ВЭЖХ базировалось на новом поколении сорбентов: микрочастицах диаметром от 3 до 10 мкм, главным образом на основе силикагеля, частично оксида алюминия, а в последнее время на основе пористых полимеров.

Силикагель всегда содержит большие, или меньшие количества адсорбированной воды. Кроме того, технический силикагель содержит другие оксиды, прежде всего оксид алюминия, также железа, который придает техническому силикагелю желтоватый или даже коричневый цвет. Силикагель имеет разную поверхность, составляющую обычно 100-600 м²/г, и значительный объем пор (0,5-1,2 мл/г) с преобладанием пор диаметром от 5 до 15 нм.

Силикагель получают разными способами, позволяющими варьировать его чистоту и другие свойства. Наиболее общим является метод получения силикагеля из так называемого жидкого стекла, представляющего собой натриевую соль поликремневой кислоты, путем его обработки кислотами с последующим высушиванием образующейся поликремневой кислоты, разлом получающегося кускового силикагеля и выделением нужной фракции рассеиванием. Такой метод был исторически первым, использовавшимся для получения силикагеля, применяемого в колоночной (классической) и тонкослойной хроматографии. На базе такого же силикагеля были получены первые сорбенты специально для ВЭЖХ типа партисил (фирма «Ватман») и лихросорб (фирма «Мерк»). Получали их путем сепарирования на специально разработанных воздушных сепараторах силикагеля для ТСХ [17].

В дальнейшем были разработаны способы получения силикагелей специально для ВЭЖХ путем направленного формования в процессе синтеза силикагеля микросфер нужной фракции с преобладанием частиц размером 3-12 мкм (фирмы Дюпон», «Мерк», «Мэчери-Нэгель», «Фейз Сепарейшн», «Сепарейшенс Груп», «Шендон Саусерн» и др.) под торговыми марками соответственно зорбакс, лихросфер, нуклеосил, сферисорб, видак, хайперсил. Стадии формирования силикагеля торговой марки зорбакс представлены на рис. 1.2 [15].

Рисунок 1.2. Стадии формирования сорбента Zorbax-Rx-SIL

В настоящее время разные фирмы производят более 200 сорбентов для ВЭЖХ на основе силикагеля, как с неправильной формой частиц, так и в виде микросфер. Ассортимент их непрерывно расширяется за счет появления новых привитых фаз к известным силикагелям для ВЭЖХ или же новых вариантов прививки тех же фаз, появления новых силикагелевых матриц с более широкими порами или более узко сепарированных, появления новых фирм-производителей [15, 17].

Химия поверхности силикагеля для ВЭЖХ независимо от способа его получения примерно одна и та же. На рис. 1.3 [17] схематически представлен поверхностный слой силикагеля, который в дальнейшем работает как адсорбент или же служит той матрицей, к которой прививают химически неподвижную фазу. На поверхности силикагеля можно обнаружить несколько видов групп, способных к взаимодействию с веществами в процессе последующего хроматографического анализа или в процессе прививки неподвижной фазы. Прежде всего, это может быть силанольная группа со свободным гидроксилом (тип I). Во-вторых, это может быть силанольная группа, свободный гидроксил которой образует с соседним атомом кислорода за счет его неподеленной пары электронов водородную связь (тип II), при этом образуется устойчивый шестичленный цикл. В-третьих, это может быть силоксановый мостик, который образуется за счет отщепления молекулы воды от двух силанольных групп (тип III). Последний тип связи может за счет обратимой реакции гидролиза превратиться в две силанольные группы (тип I).

Рисунок 1.3. Группы на поверхности силикагеля: I – свободная силанольная; II – силанольная, связанная водородной связью; III – силоксановая

Количество групп как силанольных, так и силоксановых на единицу массы силикагеля зависит от ряда факторов. Так, чем больше удельная поверхность силикагеля (она меняется в пределах от 1000 до 15 м²/г), тем больше групп обоих типов находится на сорбенте в колонке и, следовательно, сильнее удерживание взаимодействующих с ними веществ [17].

Соотношение силоксановых и силанольных групп на поверхности силикагеля зависит от длительности и условий сушки в процессе его получения. При сушке геля поликремневой кислоты исходного продукта для силикагеля сначала идет поликонденсация с выделением воды и образованием жесткого скелета силикагеля. При нагревании до 200°С вся физически сорбированная вода удаляется, а поверхность остается полностью гидроксилированной, т.е. количество силанольных групп будет максимальным, а силоксановых минимальным [15, 17]. Если продолжить нагревание, силанольные группы начнут отщеплять воду с образованием силоксановых групп; этот процесс заканчивается примерно при 1000°С.

Силанольные группы, располагающиеся на поверхности силикагеля, обладают слабокислыми свойствами и способны, поэтому сильнее удерживать вещества с основными свойствами. Силоксановые группы могут в процессе работы за счет гидролиза переходить в силанольные, что меняет свойства поверхности сорбента и удерживание веществ [15, 17].

Поверхность и структура применяемого для хроматографии оксида алюминия похожи на силикагелeвые, однако не идентичны и обеспечивают в ряде случаев селективность, отличающуюся от селективности силикагеля. Однако применение оксида алюминия в ВЭЖХ имеет ограниченный характер. Это связано с тем, что микрочастицы оксида алюминия выпускают не все фирмы-производители сорбентов, а привитые фазы на этой основе не выпускаются совсем. Тем не менее, в некоторых случаях, когда требуется селективность, отличная от селективности силикагеля, оксид алюминия применяют [17].

Сорбенты с химически привитыми фазами на основе силикагеля появились позже сорбентов, на которые неподвижная фаза (в виде индивидуальных веществ или, чаще, полимеров различной структуры и полярности) наносилась физически. Нанесенная фаза довольно быстро смывается растворителем (гораздо быстрее, чем она испаряется или изменяется в газожидкостной хроматографии), параметры удерживания постоянно меняются, препаративно собираемые фракции загрязняются фазой. Использование растворителя, насыщенного неподвижной фазой, позволило несколько повысить стабильность таких сорбентов и колонок, однако большинство недостатков при этом осталось.

Эти проблемы можно решить, если химически привить органическую неподвижную фазу к силикагелевой матрице. Силанольные группы, находящиеся в большом количестве на поверхности силикагеля (особенно полностью гидроксилированного), обладают слабокислыми свойствами и довольно легко вступают в многочисленные реакции. Первые из полученных таким путем привитофазных сорбентов, названных «щеточные» (привитые молекулы, как щетина в щетке, покрывали поверхность силикагеля), изготовляли этерификацией силанолов спиртами с образованием простой эфирной связи. Однако, обратимость реакции, особенно в кислой и щелочной средах и в присутствии водных подвижных фаз, в большой мере ограничивала, как срок работы таких сорбентов, так и области их применения. Позднее были разработаны методы получения привитых фаз разного типа с использованием гораздо более прочных и устойчивых к гидролизу связей Si-О–Si и Si-С. Практически все имеющиеся в продаже привитофазные сорбенты относятся к этому типу, их более 200 [15, 17].

Привито-фазные сорбенты сейчас наиболее популярны, несмотря на их высокую стоимость. Более 60% разделений методом ВЭЖХ выполняют с использованием только обращенно-фазных привитых сорбентов, основным из которых является сорбент с привитой фазой C₁₈.

Можно отметить следующие преимущества, обеспечивающие преобладающее использование привитых сорбентов на основе силикагеля: механическая устойчивость к высоким давлениям; отсутствие перехода привитой фазы в растворитель в процессе хроматографического разделения (если не протекают реакции, приводящие к химическому отщеплению привитой фазы); устойчивость к действию растворителей, температуры, воды, рН; возможность варьировать в широких пределах селективность за счет изменения степени прививки, дополнительной химической обработки и замены растворителя.