Нанопептиды вызывают каспазо-независимую гибель клеток.

а ВИЧ-Т _CM клетки предварительно обрабатывают с помощью 20 мкМ Z-VAD-ФМК, 50 мкМ necrostatin-1, и 200 нМ bafilomycin A ₁ в течение 2 ч и дополнительно заражали 10 мкМ NP-Beclin 1 или 10 мкМ NP-vFLIP- α2 в течение дополнительных 24 часов. Супернатанты клеточных культур собирали для анализа цитотоксичности ЛДГ. b Расщепленный CASP3 анализировали в собранных клеточных лизатах вестерн-блоттингом. Все денситометрические анализы суммированы от четырех разных доноров и нормализованы для контроля нагрузки ACTB со средними значениями. NP-S1 = 10 мкМ наноформованных скремблированных пептидов Tat-Beclin 1, NP-S2 = 10 мкМ наноформованных скремблированных пептидов Tat-vFLIP-α2. * Р  <0,05, ** Р  <0,01, *** Р  <0,001

Tat-Beclin 1 и Tat-vFLIP-α2 индуцируют Na ⁺ / K ⁺ -АТФаззависимую форму гибели клеток, аутоз

В предыдущих исследованиях , выполненных нашей лаборатории и другие, тат-Beclin 1 и тат-vFLIP-α2 , как было показано , чтобы вызвать Na ⁺ / K ⁺ -АТФазы зависимую форму гибели клеток , которая была обозначена как autosis ^{29 - 31 , 38} . Для того, чтобы определить , является ли autosis несет ответственность за селективное убийство ВИЧ-T _CM , мы оценивали экспрессию Na ⁺ / K ⁺ -АТФазы в nanopeptide обработанных ВИЧ-Т _СМ (рис. (Фиг.5А).5а ). При увеличении концентрации обоих нанопептидов мы наблюдали увеличение экспрессии альфа-1-субъединицы Na ⁺ / K ⁺-АТФаза (ATP1A1), которая является критическим каталитическим компонентом для активации Na ⁺ / K ⁺ -АТФазы. Мы также обнаружили, что оба нанопептида индуцировали дозозависимое увеличение ATP1A1 в имитированном T _CM . Однако, по сравнению с той же дозой индуцированного нанопептидом ATP1A1 в клетках _CM -ВИЧ-T , NP-Beclin 1 индуцировал в среднем на 72,1, 76,7 и 55,4% меньшую экспрессию ATP1A1 в инфицированных клетках; аналогично, NP-vFLIP-α2 индуцировал на 64,6, 69,1 и 75% меньшую экспрессию ATP1A1 в имитированных инфицированных клетках.

 

Открыть в отдельном окне

Рис. 5

NP-Beclin 1 и NP-vFLIP-α2 убивают латентные клетки _CM -HIV-T с помощью Na ⁺ / K ⁺ -ATPase-зависимого механизма.

ВИЧ-Т _КМ инкубировали с возрастающими концентрациями NP-Beclin 1 или NP-vFLIP-а2 в течение 24 ч. Собранные клеточные лизаты тестировали на экспрессию Na ⁺ / K ⁺ -АТФазы-α1-субъединицы (ATP1A1) с помощью вестерн-блоттинга. b После предварительной обработки 50 нМ дигоксином в течение 2 часов, латентные _КМ ВИЧ-Т инкубировали с NP-Beclin 1 или NP-vFLIP-α2 в течение 24 часов. Цитотоксичность контролировали с помощью анализа LDH. c Активность аутофагии анализировали в собранных клеточных лизатах с помощью вестерн-блоттинга. Все денситометрические анализы суммированы от четырех разных доноров и нормализованы для контроля нагрузки ACTB со средними значениями. NP-S ₁  = 10 мкМ наноформированных скремблированных пептидов Tat-Beclin-1, NP-S ₂ = 10 мкМ наноформированных Tat-vFLIP-α2 скремблированных пептидов. * Р  <0,05, ** Р  <0,01, *** Р  <0,001

Чтобы дополнительно установить, что индукция Na ⁺ / K ⁺ -АТФазы является механизмом гибели клеток, мы предварительно обработали культуры ТМ _CM дигоксином, известным ингибитором Na ⁺ / K ⁺ -АТФазы, за 2 ч до воздействия NP-Беклин 1 или NP-vFLIP-α2. Через 24 ч культуры, обработанные дигоксином, продемонстрировали заметное снижение гибели клеток (Fig. 5b, c ). Культуры, обработанные дигоксином, также показали заметное снижение аутофагического потока, что продемонстрировано отсутствием деградации SQSTM1 / p62. Аналогичный эффект наблюдался в экспериментах , где ATP1A1 был сбит с помощью shRNA (рис. (Рис.6).6 ). В целом эти данные подтверждают, что Na ⁺ / K⁺ -АТФаза имеет важное значение для Tat-Beclin 1 и Tat-vFLIP-α2 , индуцированного Т _СМ гибели клеток.

 

Рис. 6

Нокдаун Na ⁺ / K ⁺ -АТФазы ингибирует NP-Beclin 1 и NP-vFLIP-α2-индуцированный киллинг латентных клеток ВИЧ-T _CM .

а ВИЧ ВИЧ-Т _CM клетки трансдуцированных ш ATP1A1 для нокдауна Na ⁺ / K ⁺ -АТФазы. Эффективность нокдауна оценивали вестерн-блоттингом в клеточных лизатах. b sh ATP1A1- трансдуцированные латентные клетки _CM -HIV-T обрабатывали 10 мкМ NP-Beclin 1 или 10 мкМ NP-vFLIP-α2 в течение дополнительных 24 часов. Эффект трансдукции shATP1A1 был протестирован вестерн-блоттингом в клеточных лизатах. c Цитотоксичность измеряли анализом LDH. Все денситометрические анализы суммированы от четырех разных доноров и нормализованы для контроля нагрузки ACTB со средними значениями. NP-S ₁ = 10 мкМ наноформированные скремблированные пептиды Tat-Beclin-1, NP-S ₂  = 10 мкМ наноформированные скремблированные пептиды Tat-vFLIP-α2. ** Р  <0,01, *** Р  <0,001

ВИЧ-инфекция увеличивает Na ⁺ / K ⁺ -АТФазу в клетках памяти CD4 ⁺ T с острой и латентной инфекцией

Недавно были идентифицированы сердечные гликозиды / агликоны, которые ингибируют Na ⁺ / K ⁺ -АТФазу, чтобы ингибировать репликацию ВИЧ ^{39 - 41} . В сочетании с нашими результатами, представленными здесь, мы предположили, что клетки, латентно инфицированные ВИЧ, могут повышать активность Na ⁺ / K ⁺ -АТФазы, что способствует генерации латентности. Для этих экспериментов были установлены и оценены _CM -HIV-T на наличие ATP1A1. Представляет интерес, поскольку репликация вируса в T _CM прогрессировали к латентности, количество ATP1A1 не обнаружено постоянно увеличивается в течение 30 дней (фиг. (Фиг.7А).7а ). Изучить потенциальную функцию Na⁺ / K ⁺ -АТФаза в генерации _КМ ВИЧ-T , мы инкубировали ингибитор Na ⁺ / K ⁺ -АТФазы дигоксин с ВИЧ-инфицированными CD4 ⁺ T-клетками и поддерживали лечение дигоксином в течение 30 дней, когда инфекция прогрессировала до латентного периода. По мере развития инфекции, производство р24 ВИЧ был значительно ниже в клетках , обработанных дигоксина (рис. (Фиг.7В).7b ). При обработанных и необработанных культурах достигли латентность, эти клетки , обработанных с дигоксином имели среднее 0,2 копий провирусной ДНК на клетки по сравнению с 1,3 ВИЧ-Т _CM управления (рис. (Рис.7с7c ).

 

Рис. 7

ВИЧ-инфекция увеличивает Na ⁺ / K ⁺ -АТФазу в CD4 ⁺ покоящихся Т-клетках памяти.

уровень экспрессии ATP1A1 измеряли с помощью Вестерн - блоттинга клеточных лизатов CD4 ⁺ клеток памяти Т. b CD4 ⁺ Т-клетки предварительно обрабатывали 50 нМ дигоксином в течение 2 ч с последующей инфекцией ВИЧ _NL-43 (MOI = 0,1). Инфицированные CD4 ⁺ Т-клетки инкубировали с 50 нМ дигоксина в течение 12 дней. Супернатанты клеточных культур тестировали на ВИЧp24 с помощью ELISA. c В день 12 пи обработанные дигоксином CD4 ⁺ T-клетки подвергались магнитно-отрицательному отбору для обогащения CD4 ⁺ T-клеток центральной памяти . Очищенный CD4 ⁺Т-клетки памяти обрабатывали 50 нМ дигоксином, 100 нМ атазанавиром и 200 нМ тенофовиром в течение еще 20 дней. Собранные клетки измеряли для интегрированной ДНК ВИЧ с использованием Alu-gag QPCR. Все анализы суммированы по четырем различным донорам и нормализованы по контрольной нагрузке ACTB со средним значением. * Р  <0,05, *** Р  <0,001

Нанопептиды преимущественно убивают ex vivo латентные CD4 ⁺ T-клетки в крови пациента

Чтобы подтвердить, что нанопептиды могут преимущественно убивать латентно инфицированные клетки ВИЧ, мы провели исследования ex vivo на образцах пациентов. РВМС были получены из крови ВИЧ-инфицированных пациентов с вирусной супрессией на АРТ, с неопределяемыми вирусными нагрузками, определяемыми как <20 копий РНК ВИЧ / мл в течение не менее 12 месяцев, и числом CD4 ⁺ > 400 / мм ³ . Отдыхающие CD4 ⁺ Т-клетки выделяли из РВМС и обрабатывали нанопептидами в течение 24 часов, следуя методам, ранее описанным нашей лабораторией ³⁴ . После обработки не было заметного увеличения количества мертвых клеток в обработанных по сравнению с контрольными культурами. Это неудивительно, учитывая, что латентно инфицированные клетки составляют <10 на 10 ⁶ клеток in vivo (рис.8а, б ).

 

Рис. 8

Нанопептиды уменьшают латентную инфекцию ВИЧ в покоящихся CD4 ⁺ Т-клетках от пациентов с ВИЧ ex vivo.

а ВИЧ-инфицированные пациенты , которые получали подавляющий антиретровирусную терапию, были вирусологической подавлены в течение> 12 месяцев (<20 копий РНК ВИЧ / мкл) и был> 400 CD4 ⁺ клеток / мл были набраны для донорства крови. Очищенные покоящиеся CD4 ⁺ Т-клетки обрабатывали 10 мкМ NP-Beclin 1 или 10 мкМ NP-vFLIP-α2 в течение 24 часов, а затем активировали посредством PHA и γ-облучения. Компетентный по репликации вирус, реактивированный из CD4 ⁺ Т-клеток, измеряли с использованием количественного анализа вирусного роста (QVOA). b Цитотоксичность NP-Beclin 1 и NP-vFLIP-α2 тестировали с окрашиванием трипановым синим у очищенных пациентов, покоящихся CD4 ⁺ T-клеток после 24-часовой обработки. сРезультаты QVOA были определены с помощью ELISA HIVp24 и проанализированы с помощью статистики максимального правдоподобия. Данные суммированы по семи различным донорам и нанесены на график с помощью средств. IUPM = количество инфекционных единиц на миллион покоящихся CD4 ⁺ T-клеток, NP-S ₁  = 10 мкМ наноформированных скремблированных пептидов Tat-Beclin-1, NP-S ₂  = 10 мкМ наноформованных скремблированных пептидов Tat-vFLIP-α2. ** Р  <0,01

Для выявления элиминации латентно инфицированных ВИЧ-клеток, которые продуцируют компетентный к репликации вирус, использовали количественный анализ вирусного роста (QVOA) ³⁴ . Отдыхающие CD4 ⁺ Т-клетки выделяли и обрабатывали нанопептидами в течение 24 часов, а CD4 ⁺ Т-клетки серийно разводили и подвергали количественному анализу разрастания в лимитирующем разведении. После однократной обработки NP-Beclin 1 и NP-vFLIP-& alpha ; 2, количество репликации компетентного вируса была снижена 70,8 и 71,8%, соответственно (рис. (Fig.8c),8c), тогда как скремблированные контрольные нанопептиды не имели эффекта. Таким образом, эти данные предоставляют дополнительные доказательства того, что Tat-Beclin 1 и Tat-vFLIP-α2 способны преимущественно устранять латентно инфицированные ВИЧ клетки с минимальной цитотоксичностью по отношению к неинфицированным клеткам in vivo.

Ингибирование Na ⁺ / K ⁺ -АТФазы предотвращает индуцированное нанопептидом уничтожение ВИЧ-латентных CD4 ⁺ Т-клеток пациента ex vivo.

Чтобы определить механизм опосредованного нанопептидами преимущественного уничтожения пациентов с латентно инфицированными CD4 ⁺ Т-клетками, мы проверили, зависело ли снижение компетентного по репликации вируса от индукции Na ⁺ / K ⁺ -АТФазы, ведущей к аутозу. В этих исследованиях покоящиеся CD4 ⁺ Т-клетки пациента инкубировали с дигоксином в течение 2 часов с последующей обработкой нанопептидами в течение дополнительных 24 часов, после чего компетентный по репликации вирус оценивали с помощью QVOA. После обработки дигоксином анти-ВИЧ и уничтожение клеток латентно инфицированных клеток NP-Beclin 1 и NP-vFLIP-α2 были обращены вспять, и было обнаружено небольшое различие в количестве инфекционного вируса между необработанным и обработанным дигоксином плюс нанопептидом пациентом (Дополнение Рис.3 ) Таким образом, эти результаты подтверждают, что наши нанопептиды индуцируют Na ⁺ / K ⁺ -АТФаззависимую гибель клеток, которую можно обратить путем ингибирования Na ⁺ / K ⁺ -АТФазы.

Перейти к:

обсуждение

Значительные данные подтверждают, что ВИЧ-инфекция вызывает апоптоз в активированных CD4 ⁺ Т-клетках, нарушая иммунную функцию хозяина ^{42 - 46} . Тем не менее, в некоторых клетках ВИЧ изменяет профиль транскрипции, чтобы стимулировать активацию антиапоптотических белков, что приводит к увеличению выживаемости клеток ^{47 - 51} . Кроме того, во время пермиссивной инфекции ВИЧ Nef связывается с беклином 1, ключевым белком аутофагии, что приводит к подавлению аутофагии, которая может привести к предотвращению аутолизосомной деградации вируса ^{23 , 52}, Ранее нами было продемонстрировано, что обработка макрофагов Tat-Beclin 1 и Tat-vFLIP-α2 запускает избирательное уничтожение ВИЧ-инфицированных макрофагов, одновременно освобождая неинфицированные макрофаги ³¹ . Тем не менее, считается, что основной участок резервуара ВИЧ у лиц, получающих АРТ, находится в долгоживущих покоящихся CD4 ⁺ Т-клетках памяти . Таким образом, в текущей работе мы сосредоточили наши исследования на этой клеточной популяции. Наши результаты демонстрируют как в модели in vitro, так и в исследованиях ex vivo, что NP-Beclin 1 и NP-vFLIP-α2 могут индуцировать селективное уничтожение латентной покойной ВИЧ-инфицированной CD4 ^{+ с} памятью покоя.Т-клетки, сохраняя при этом незараженные клетки и предотвращая новую инфекцию клеток-наблюдателей. Наши исследования также показали, что преимущественное уничтожение клеток, латентно инфицированных ВИЧ, обусловлено, по крайней мере частично, повышенной чувствительностью инфицированных клеток к изменениям в Na ⁺ / K ⁺ -АТФазе, приводя клетки к специфической форме клеток, опосредованных аутофагией смерть, ауто.

В настоящее время ведется расследование многочисленных стратегий лечения ВИЧ. Хотя трансплантация CCR5Δ32 гомозиготных гемопоэтические стволовые клетки по- видимому, привела к лечению ВИЧ в течение одного или двух пациентов ^{53 - 55} , эта стратегия является непрактичной и применялась только для пациентов с злокачественными опухолями. Подходы генной терапии, с другой стороны, пытаются имитировать эту стратегию с использованием нуклеаз цинкового пальца для нацеливания на CCR5 и в последнее время кластеризованные регулярно пересекающиеся короткие палиндромные повторы (CRISPR) / Cas-9 ^{56 - 61}, Другие подходы к редактированию генов пытаются использовать факторы ограничения хозяина для конструирования клеток, чтобы противостоять ВИЧ-инфекции. Дополнительные стратегии, направленные на реактивацию ВИЧ из латентно инфицированных клеток с использованием агентов, изменяющих латентность, в рамках так называемого подхода «шок и убийство», при котором вирус реактивируется и впоследствии убивается антиретровирусными препаратами, а в некоторых случаях в сочетании с широко нейтрализующими антителами ^{5 , 62}, Многие другие подходы пытаются модулировать иммунный ответ на ВИЧ, чтобы контролировать инфекцию без необходимости антиретровирусного лечения для достижения того, что было названо «функциональным излечением». Здесь мы разработали новый подход, который позволяет убивать латентно инфицированные ВИЧ-клетки по преимуществу, оставляя незараженные клетки незащищенными. Этот подход основан на нескольких важных принципах: (1) Аутофагия необходима для поддержания клеточного гомеостаза и персистенции латентных резервуаров ВИЧ; (2) Несмотря на то, что он является важным механизмом выживания, чрезмерные уровни аутофагии способны вызывать аутофагийную гибель клеток; (3) Аутозис является зависимой от аутофагии неапоптотической формой гибели клеток и может быть вызвана индуцирующими аутофагию пептидами посредством индукции Na ⁺ / K ⁺-АТФазы; и (4) индукция аутоза в дополнение к уничтожению клеток с репликацией ВИЧ может убивать латентно инфицированные ВИЧ клетки, которые не подвергаются вирусной репликации без реактивации вируса.

Считается, что покоящиеся CD4 ⁺ T- _CM клетки, несущие компетентную к репликации латентную провирусную ДНК, остаются в состоянии покоя в течение многих лет только для образования ВИЧ после активации. Хотя роль аутофагии в установлении скрытой ВИЧ-инфекции в покоящихся CD4 ⁺ Т- клетках _CM неизвестна, многие исследования показали, что аутофагия необходима для генерации Т-клеток памяти и поддержания ее иммунной функции ^{63 - 65} . В CD8 ⁺ Т-клетках памяти истощение ATG5 и ATG7 непосредственно вызывает гибель клеток и ухудшает фенотип памяти ^66., Наши предыдущие исследования выявили противовирусный эффект аутофагии в борьбе с ВИЧ-инфекцией в первичных макрофагах человека и CD4 ⁺ Т-клетках памяти посредством формирования аутофагосомного и аутолизосомного опосредованного захвата и деградации вирусных белков ^{24 - 26 , 31 , 34} . В данном исследовании мы также определить , что автофагии индуцирующих пептиды обладают потенциалом для устранения ВИЧ - инфекции в латентной T _CM клетки с использованием механизма аутофагии-зависимой.

Чтобы улучшить трансляционный потенциал нашего подхода, мы загрузили индуцирующие аутофагию пептиды в покрытые липидом гибридные наночастицы PLGA с использованием биосовместимых и биоразлагаемых материалов. Сочетая уникальные свойства липосом и полимерных наночастиц, наши гибридные наночастицы PLGA с липидным покрытием способны эффективно доставлять капсулированные грузы ⁶⁷ . В этом исследовании мы успешно загрузили Tat-Beclin 1 или Tat-vFLIP-α2 в гибридные наночастицы, что привело к замедленному высвобождению индуцирующих аутофагию пептидов в течение 96 часов. Было показано, что эта наноформация липидного гибрида PLGA увеличивает биодоступность индуцирующих аутофагию пептидов в макрофагах человека в течение почти одной недели в нашем предыдущем исследовании ³¹, Действительно, гибридные наночастицы улучшили внутриклеточную биодоступность наших пептидов для ВИЧ-инфицированных клеток и превратили инкапсулированный пептидный препарат в биосовместимый и трансляционный препарат-кандидат ⁶⁸ . Недавно мы разработали новую целевую версию наночастиц PLGA с поверхностным покрытием плазматической мембраны CD4 ⁺ T-клеток, которая широко распознает белок оболочки ВИЧ, гликозилированный белок 120 (gp120) ⁶⁹ . Эта полимерная наночастица, покрытая плазматической мембраной CD4 ^+, имеет высокую аффинность связывания с gp120 ВИЧ, что приводит к сильной антиретровирусной активности благодаря нейтрализации внеклеточного ВИЧ, входящего в CD4 ⁺Т-клетки и макрофаги. Эта новая композиция обладает потенциалом для улучшения целевого уничтожения всех ВИЧ-gp120-позитивных клеток, включая хронически инфицированные и реактивированные латентно-инфицированные клетки.

Таким образом, мы определили, что два нанопептида, Tat-Beclin 1 и Tat-vFLIP-α2, нацеленные на белки, критические для аутофагии, индуцируют Na ⁺ / K ⁺ -АТФазу и избирательно убивают ВИЧ-латентно инфицированные CD4 ⁺ T-клетки памяти в состоянии покоя с небольшим влиянием на неинфицированные клетки. Преимущественное уничтожение латентно инфицированных клеток зависит от увеличения Na ⁺ / K ⁺ -АТФазы, поскольку индукция гибели клеток может быть устранена дигоксином, ингибитором Na ⁺ / K ^+.-АТФазы. Эти пептиды при загрузке в наночастицы PLGA могут доставляться и включаться в ВИЧ-инфицированные клетки и синтезироваться из одобренного FDA материала, что облегчит их способность использоваться людьми. Таким образом, мы считаем, что эти пептиды имеют большой потенциал для использования в качестве части общей стратегии, направленной на ликвидацию ВИЧ от инфицированных людей.

Перейти к:

материалы и методы

Этика заявление

Венозную кровь получали от ВИЧ-серонегативных и ВИЧ-серопозитивных доноров. Протокол был рассмотрен и утвержден Программой защиты исследований человека в Калифорнийском университете в Сан-Диего (проект 09-0660). Письменное информированное согласие было получено от всех доноров крови.

Приготовление NP-Беклина 1 и NP-vFLIP-α2

Аутофагия индуцирующие пептиды , включая Tat-Beclin 1 (RRRQRRKKRGY-GG-TGFEGDHWIEFTANFVNT), омлет Tat-Beclin 1 (RRRQRRKKRGY-GG-WETAFGTTEHNIFFDNGV), Tat-vFLIP-а2 (RRRQRRKKRGY-GFVNLLFLVVE) и платные Tat-vFLIP-а2 (RRRQRRKKRGY- GFVNLAAAVVE), были синтезированы в D-изомерной последовательности и получены от New England Peptide, Inc. Наночастицы PLGA, покрытые липидами, индуцирующими аутофагию, были синтезированы с использованием одностадийной нанопреципитации. Поли ( _{D, L-} молочная-со-гликолевая кислота) PLGA (50:50, 0,67 дл / г, Pelham, AL) с концевыми эфирами и индуцирующими аутофагию пептидами растворяли в органическом растворителе ацетонитриле при 10 мг / мл. Соевый лецитин и DSPE-PEG ₂₀₀₀-COOH (1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин-N-карбокси (полиениленгликоль) 2000) (Alabaster, AL) смешивали в хлороформе при 20% веса полимера PLGA и сушили на воздухе в виде липида фильм. Растворенный органический раствор PLGA / аутофагий-индуцирующих пептидов добавляли в липидную пленку при осторожном перемешивании и дополнительно встряхивали в течение 3 минут. Затем наночастицы PLGA промывали 10 мМ трис-HCl pH 8 буфером и загружали индуцирующими аутофагию пептидами. Оставшийся ацетонитрил и свободные полимеры удаляли промывкой с использованием центробежного фильтра Amicon Ultra-4 (Millipore, Billerica, MA) с отсечкой молекулярной массы 10 кДа.

Характеристика NP-Беклина 1 и NP-vFLIP-α2

Морфологические характеристики NP-Beclin 1 и NP-vFLIP-α2 оценивали с помощью просвечивающей электронной микроскопии JEOL Gatan (TEM) с использованием отрицательного окрашивания. Размер, индекс полидисперсности и дзета-потенциал поверхности измеряли динамическим рассеянием света Malvern Zetasizer Nano ZS для каждой из наноформаций. Способность к загрузке пептида оценивали с помощью диализной микропробирки Slide-A-Yzer MINI с отсечкой молекулярной массы 3,5 кДа (Thermofisher, Rockford, IL) и определяли по весовому соотношению полезной нагрузки пептида к наночастицам PLGA.

Генерация ВИЧ латентно инфицированных первичных покоящихся CD4 ⁺ Т-клеток памяти

ВИЧ-латентно инфицированные Т-клетки памяти покоя генерировались в соответствии с нашим ранее опубликованным протоколом ³⁴ . Вкратце, CD4 ⁺ Т-клетки памяти в состоянии покоя от неинфицированных ВИЧ доноров суспендировали в среде RPMI 1640 с 10% эмбриональной бычьей сывороткой с добавлением 29 нМ CCL19 (PeproTech, Rocky Hill, NJ) в течение 48 часов. Затем CD4 ⁺ Т-клетки инфицировали ВИЧ _NL4-3 при множественности инфекции (MOI) 0,1 и инкубировали с 250 нг / мл стафилококкового энтеротоксина B (Sigma, St.Louis, MO) и 25 ед / мл IL -2 (Рош, Базель, Швейцария) на дополнительные 3 дня. После удаления стафилококкового энтеротоксина клетки культивировали с 25 ед. / Мл IL-2 в течение еще 9 дней. Затем центральная память CD4 ⁺Т-клетки очищали от ВИЧ-инфицированных CD4 ⁺ Т-клеток, используя отрицательную магнитную изоляцию, и дополнительно культивировали с 1 нг / мл IL-7 (PeproTech, Rocky Hill, NJ), 100 нМ атазанавира и 200 нМ тенофовира (Selleckchem, Houston, TX) ) еще на 20 дней.

Количественный анализ вирусного роста латентного CD4 ⁺ Т ex vivo в изолированной крови пациента

Наша лаборатория адаптировала количественный анализ роста вируса (QVOA), ранее установленный в лаборатории Силиано ^{34 , 70} . ВИЧ-инфицированные пациенты, которые были вирусологически подавлены на АРТ, имели вирусную нагрузку <20 копий / мл в течение не менее 12 месяцев и имели уровень CD4 +> 400 клеток / мм ^3, были набраны и получили информированное согласие в Университете Калифорнии в Сан-Диего Клиника Программы ВИЧ-инфекции «Мать-дитя-подросток» и мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) были выделены из собранной венозной крови с использованием центрифугирования с плотностью Ficoo-Paque ^TM (GE Healthcare, Pittsburgh, PA). Отдыхая CD4 ⁺Т-клетки очищали путем выделения отрицательных магнитных клеток человеческого CD25, CD69 и анти-HLA-DR в соответствии с протоколами производителя и реактивировали гамма-излучением (5000R в Cs-источнике) и фитогемагглютинином (PHA-M, 1 мкг / мл). РВМС, истощенные по CD8 ⁺ Т-клеткам, реактивировали PHA-M и использовали в качестве питающих клеток для совместного культивирования с ограниченным разведением покоящихся CD4 ⁺ Т-клеток в течение 3 недель. Собранные супернатанты клеточных культур тестировали с помощью антигена p24 ВИЧ с использованием ELISA.

Вестерн-блоттинг

Собранные клеточные лизаты смешивали с буфером для образцов, восстанавливающим маркер Пирса-Лейна (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA), и кипятили в течение 5 минут для достижения денатурации белка. Образцы белка разделяли гелями ExpressPlus PAGE и электрофоретически переносили на PVDF или нитроцеллюлозную мембрану. Белки-мишени были обнаружены первичными анти-LC3B (Novus Biologicals, Littleton, CO), анти-ATP1A1, анти-ATG5, анти-ATG7 (Cell Signaling Technology, Danvers, MA) и анти-SQSTM1 антителами (Abcam, Cambridge, MA) ). Конъюгированные с пероксидазой хрена козьи антимышиные и кроличьи вторичные антитела использовали для амплификации обнаруженного антигена.

Анализ цитотоксичности

Собранные супернатанты клеточных культур совместно инкубировали с реакционным буфером для анализа цитотоксичности LDH в соответствии с протоколом изготовления (Clontech, Mountain View, CA). Колориметрические результаты количественно определяли с использованием считывающего устройства для микропланшетов BioTek при длине волны 490 нм. Мертвые клетки окрашивали 0,4% раствором трипанового синего и количественно определяли с помощью счетчика клеток Nexcelom.

TZM-bl анализ на ВИЧ-инфекцию

ВИЧ-инфекция TZM-bl была проверена в соответствии с установленным протоколом ³⁵ . Вкратце, собранные супернатанты клеточных культур загружали в 96-луночные планшеты, содержащие 50000 TZM-bl клеток на лунку в среде RPMI 1640 с 10% FBS, и инкубировали при 37 ° C в течение 48 часов. После промывания инкубированные клетки TZM-bl измеряли с помощью набора для анализа Beta-Glo (Promega, Madison, WI).

Измерение ВИЧ-инфекции

Геномная ДНК из T _CM была выделена с помощью наборов PureLink® Genomic DNA (Invitrogen, Carlsbad, CA). В соответствии с установленным протоколом ^{71 - 73} , интегрированную вирусную ДНК измеряли с помощью Alu-gag QPCR. Выделенную геномную ДНК из клеточных линий ACH-2 и 8E5 использовали в качестве стандартов ВИЧ. Собранные супернатанты клеточных культур тестировали на ELISA на ВИЧp24 (PerkinElmer, Waltham, MA) и активность RT (ThermoFisher, Carlsbad, CA) в соответствии с протоколом изготовления.

РНК-интерференция

Наборы с короткими шпилечными РНК-лентивирусными частицами для трансдукции были приобретены у Sigma-Aldrich для подавления ATG5, ATG7 и ATP1A1 в первичных центральных клетках памяти CD4 + T (ATG5-TRCN0000151963, ATG7-TRCN0000435480 и ATP1A1-TRCN0000424769). Лентивирусная shРНК была трансдуцирована в соответствии с протоколами производителя. контрольный вектор shRNA также был получен от Sigma-Aldrich, используемой в качестве контроля неспецифического нацеливания (SHC002).

Статистика

Все результаты были оценены в GraphPad Prism 6.0 (GraphPad, La Jolla, CA). Нормализованные данные, включая изменения сгиба и отношения, были преобразованы в значение log2 для нормализации данных. Два Стьюдента т тест, дисперсионный анализ, корреляция Пирсона и ранговый критерий Уилкоксона были применены для статистического анализа. P значение <0,05 двухвостых считалось статистически значимым.

Перейти к:

Дополнительная информация

Дополнительные ^{рисунки} 1, 2 и 3 ^{(541K, docx)}

Перейти к:

Подтверждения

Мы благодарим Эрин Мауле, Джонатана Хана и Морселя Хамиди за помощь в проведении экспериментов, а также Сию Чжу и Чжэ Чжуна за помощь в иллюстрации и статистическом анализе. Эта работа была полностью или частично поддержана Национальным институтом неврологических расстройств и инсульта NIH в рамках гранта R01 NS084912 и R01 NS104015; Международная сеть клинических испытаний СПИДа среди матерей и детей. Общая поддержка Международной сети клинических испытаний педиатрического СПИДа среди матерей (IMPAACT) была оказана Национальным институтом аллергии и инфекционных заболеваний (NIAID) Национального института здравоохранения (NIH) в рамках гранта UM1AI068632 (IMPAACT LOC), UM1AI068616 (IMPAACT SDM ) и UM1AI106716 (IMPAACT LC),

Перейти к:

Вклад авторов

GZ, LZ и SAS разработали и разработали исследование. GZ, BTL, XW, GRC, RHF проводили эксперименты. GZ, LZ и SAS проанализировали данные. GZ, LZ и SAS написали рукопись.

Перейти к:

Конфликт интересов

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

Перейти к:

Сноски

Под редакцией Т. Кауфмана

Примечание издателя: Springer Nature остается нейтральным в отношении юрисдикционных претензий на опубликованных картах и ​​институциональных принадлежностей.

Перейти к:

Дополнительная информация

Дополнительная информация прилагается к этому документу в (10.1038 / s41419-019-1661-7).

Перейти к:

Рекомендации

1. Йошимура К. Современное состояние ВИЧ / СПИДа в эпоху АРТ. J. Infect. Chemother. 2017; 23 : 12–16. doi: 10.1016 / j.jiac.2016.10.002. [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Scholar ]

2. Rainwater-Lovett K, Luzuriaga K, Persaud D. Очень ранняя комбинированная антиретровирусная терапия у детей раннего возраста: перспективы излечения. Тек. ОПИН. ВИЧ СПИД 2015; 10 : 4–11. doi: 10.1097 / COH.0000000000000127. [ PMC бесплатная статья ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Scholar ]

3. Чун Т.В. и др. Восстановление плазменной виремии после прекращения антиретровирусной терапии, несмотря на глубоко низкий уровень резервуара ВИЧ: последствия для ликвидации. СПИД. 2010; 24 : 2803–2808. doi: 10.1097 / QAD.0b013e328340a239. [ PMC бесплатная статья ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Scholar ]

4. Чун Т.В., Моир С., Ковач С., Фаучи А.С. Восстановление плазменной виремии после прекращения антиретровирусной терапии, несмотря на крайне низкий уровень резервуара ВИЧ: последствия для ликвидации Ответ. СПИД. 2011; 25 : 872–873. doi: 10.1097 / QAD.0b013e328344c25a. [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Scholar ]

5. Дикс С.Г. ВИЧ шокирует и убивает. Природа. 2012; 487 : 439–440. doi: 10.1038 / 487439a. [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Scholar ]

6. Финци Д. и соавт. Выявление резервуара для ВИЧ-1 у пациентов, получающих высокоактивную антиретровирусную терапию. Наука. 1997; 278 : 1295–1300. doi: 10.1126 / science.278.5341.1295. [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Scholar ]

7. Мюррей А.Дж., Квон К.Дж., Фарбер Д.Л., Силичано Р.Ф. Латентный резервуар для ВИЧ-1: как иммунологическая память и клональная экспансия способствуют персистенции ВИЧ-1. J. Immunol. 2016; 197 : 407–417. doi: 10.4049 / jimmunol.1600343. [ PMC бесплатная статья ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Scholar ]

8. Чун Т.В. и др. Наличие индуцибельного латентного резервуара ВИЧ-1 во время высокоактивной антиретровирусной терапии. Proc Natl Acad. Sci. СОЕДИНЕННЫЕ ШТАТЫ АМЕРИКИ. 1997; 94 : 13193–13197. doi: 10.1073 / pnas.94.24.13193. [ PMC бесплатная статья ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Scholar ]

9. Деретик В., Сайтох Т., Акира С. Аутофагия при инфекциях, воспалениях и иммунитетах. Туземный Преподобный Иммунол. 2013; 13 : 722–737. doi: 10.1038 / nri3532. [ PMC бесплатная статья ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Scholar ]

10. Чой Й., Боуман Дж.У., Юнг Ю.У. Аутофагия при вирусной инфекции - обоюдоострый меч. Туземный Rev. Microbiol. 2018; 16 : 340–353. doi: 10.1038 / s41579-018-0003-6. [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Scholar ]

11. Lamb CA, Yoshimori T, Tooze SA. Аутофагосома: происхождение неизвестно, комплекс биогенеза. Туземный Преподобный Мол. Cell. Bio. 2013; 14 : 759–774. doi: 10.1038 / nrm3696. [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Scholar ]

12. Баттон Р.У., Робертс С.Л., Уиллис Т.Л., Ханеман К.О., Ло С.К. Накопление аутофагосом придает цитотоксичность. J. Biol. Химреагент 2017; 292 : 13599–13614. doi: 10.1074 / jbc.M117.782276. [ PMC бесплатная статья ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Scholar ]

13. Фульда С., Когель Д. Клеточная гибель от аутофагии: новые молекулярные механизмы и последствия для терапии рака. Онкогенов. 2015; 34 : 5105–5113. doi: 10.1038 / onc.2014.458. [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Scholar ]

14. Доэрти J, Baehrecke EH. Жизнь, смерть и аутофагия. Туземный Cell. Biol. 2018; 20 : 1110–1117. doi: 10.1038 / s41556-018-0201-5. [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Scholar ]

15. Nardacci R, et al. Роль аутофагии в ВИЧ-инфекции и патогенезе. J. Intern. Med. 2017; 281 : 422–432. doi: 10.1111 / joim.12596. [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Scholar ]

16. Gomez-Mora E, et al. Краткий отчет: Нарушение реакции Т-клеток CD4 на аутофагию у пролеченных людей, инфицированных ВИЧ-1. J. Acquir. Иммунный Дефицит. Syndr. 2017; 74 : 201–205. doi: 10.1097 / QAI.0000000000001201. [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Scholar ]

17. Мао К, Клионский DJ. Ксенофагия: поле битвы между хозяином и микробом и возможный путь лечения рака. Аутофагия. 2017; 13 : 223–224. doi: 10.1080 / 15548627.2016.1267075. [ PMC бесплатная статья ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Scholar ]

18. Вилеман Т. Аутофагия как защита от внутриклеточных патогенов. Очерки биохимии. 2013; 55 : 153–163. doi: 10.1042 / bse0550153. [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Scholar ]

19. Nardacci R, et al. Аутофагия играет важную роль в сдерживании ВИЧ-1 у пациентов, не инфицированных прогрессором. Аутофагия. 2014; 10 : 1167–1178. doi: 10.4161 / auto.28678. [ PMC бесплатная статья ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Scholar ]

20. Чжоу Д.Д., Маслия Е., Спектор С.А. Аутофагия усиливается в посмертном мозге людей с энцефалитом, ассоциированным с ВИЧ-1. J. Infect. Дис. 2011; 203 : 1647–1657. doi: 10.1093 / infdis / jir163. [ PMC бесплатная статья ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Scholar ]

21. Чжоу Д.Дж., Кан К.Х., Спектор С.А. Продукция интерферона альфа вирусом иммунодефицита человека типа 1 в плазмоцитоидных дендритных клетках человека зависит от индукции аутофагии. J. Infect. Дис. 2012; 205 : 1258–1267. doi: 10.1093 / infdis / jis187. [ PMC бесплатная статья ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Scholar ]

22. Чжоу Д.Д., Спектор С.А. Инфекция вируса иммунодефицита человека типа 1 подавляет аутофагию. СПИД. 2008; 22 : 695–699. doi: 10.1097 / QAD.0b013e3282f4a836. [ PMC бесплатная статья ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Scholar ]

23. Кэмпбелл Г.Р., Рават П., Брукман Р.С., Спектор С.А. Вирус иммунодефицита человека типа 1 Nef ингибирует аутофагию через секвестрацию фактора транскрипции EB. Плос Патог. 2015; 11 : e1005018. doi: 10.1371 / journal.ppat.1005018. [ PMC бесплатная статья ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Scholar ]

24. Кэмпбелл Г.Р., Спектор С.А. Витамин D ингибирует вирус иммунодефицита человека типа 1 и инфекцию Mycobacterium Tuberculosis в макрофагах посредством индукции аутофагии. Плос Патог. 2012; 8 : e1005018. [ PMC бесплатная статья ] [ PubMed ] [ Google Scholar ]

25. Кэмпбелл Г.Р., Спектор С.А. Гормонально активный витамин D3 (1-альфа, 25-дигидроксихолекальциферол) запускает аутофагию в макрофагах человека, которая ингибирует инфекцию ВИЧ-1. J. Biol. Химреагент 2011; 286 : 18890–18902. doi: 10.1074 / jbc.M110.206110. [ PMC бесплатная статья ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Scholar ]

26. Кэмпбелл Г.Р. и соавт. Индукция аутофагии ингибиторами PI3K / MTOR и PI3K / MTOR / BRD4 подавляет репликацию ВИЧ-1. J. Biol. Химреагент 2018; 293 : 5808–5820. doi: 10.1074 / jbc.RA118.002353. [ PMC бесплатная статья ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Scholar ]

27. Shoji-Kawata S, et al. Идентификация кандидата терапевтического аутофагического пептида. Природа. 2013; 494 : 201–206. doi: 10.1038 / nature11866. [ PMC бесплатная статья ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Scholar ]

28. Lee JS, et al. FLIP-опосредованная регуляция аутофагии в контроле гибели клеток. Туземный Cell. Biol. 2009; 11 : 1355 – U1225. doi: 10.1038 / ncb1980. [ PMC бесплатная статья ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Scholar ]

29. Лю Y и соавт. Аутозис является Na +, K + -АТФаз-регулируемой формой гибели клеток, вызванной аутофагий-индуцирующими пептидами, голоданием и гипоксией-ишемией. Proc. Natl Acad. Sci. СОЕДИНЕННЫЕ ШТАТЫ АМЕРИКИ. 2013; 110 : 20364–20371. doi: 10.1073 / pnas.1319661110. [ PMC бесплатная статья ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Scholar ]

30. Лю Й., Левин Б. Аутоз и аутофагическая гибель клеток: темная сторона аутофагии. Cell Death Differ. 2015; 22 : 367–376. doi: 10.1038 / cdd.2014.143. [ PMC бесплатная статья ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Scholar ]

31. Чжан Г., Лук Б.Т., Хамиди М., Чжан Л.Ф., Спектор С.А. Индукция Na + / K + -АТФаззависимой формы аутофагии запускает преимущественную гибель клеток макрофагов, инфицированных вирусом иммунодефицита человека типа 1. Аутофагия. 2018; 14 : 1359–1375. doi: 10.1080 / 15548627.2018.1476014. [ PMC бесплатная статья ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Scholar ]

32. Soriano-Sarabia N, et al. Количественная оценка компетентного по репликации ВИЧ-1 в популяциях покоящихся CD4 + Т-клеток. J. Virol. 2014; 88 : 14070–14077. doi: 10.1128 / JVI.01900-14. [ PMC бесплатная статья ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Scholar ]

33. Сун Дж. М., Марголис Д. М. Постоянство ВИЧ на антиретровирусной терапии и барьеры на пути к излечению. Adv. Exp. Med. Biol. 2018; 1075 : 165–185. doi: 10.1007 / 978-981-13-0484-2_7. [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Scholar ]

34. Кэмпбелл Г.Р., Брукман Р.С., Чу Ю.Л., Форель Р.Н., Спектор С.А. Миметики SMAC индуцируют аутофагиозно-зависимый апоптоз CD4 + T-клеток с покоящейся памятью, инфицированных ВИЧ-1. Клетка-хозяин Микроб. 2018; 24 : 689–702.e7. doi: 10.1016 / j.chom.2018.09.007. [ PMC бесплатная статья ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Scholar ]

35. Саньял А. и соавт. Новый анализ показывает большой индуцибельный, компетентный к репликации резервуар ВИЧ-1 в покоящихся CD4 (+) Т-клетках. Туземный Med. 2017; 23 : 885–889. doi: 10,1038 / нм.4347. [ PMC бесплатная статья ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Scholar ]

36. Вольф Б.Б., Шулер М., Эчеверри Ф., Грин Д.Р. Каспаза-3 является основным активатором апоптотической фрагментации ДНК через фактор фрагментации ДНК-45 / ингибитор инактивации каспазо-активированной ДНКазы. J. Biol. Химреагент 1999; 274 : 30651–30656. doi: 10.1074 / jbc.274.43.30651. [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Scholar ]

37. Макилвейн Д.Р., Бергер Т., Мак Т.В. Функции каспазы в гибели и заболевании клеток. Csh Perspect. Biol. 2013; 5 : a008656. [ PMC бесплатная статья ] [ PubMed ] [ Google Scholar ]

38. Хелуфи М., Буланжер С.М., Кодоньо П., Рауту П.Е. Аутозис возникает в печени пациентов с тяжелой нервной анорексией. Гепатологии. 2015; 62 : 657–658. doi: 10.1002 / hep.27597. [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Scho