Характеристика конечного продукта.

Пириформин – биопрепарат на основе гриба Conidiobolus thromboides (= Entomophthora pyriformes). Разработан в жидкой и сухой формах. Основное действующее начало – конидии и покоящиеся споры гриба.

Штамм E. Pyriformes-78-2 выделен в 1978 году из гороховой тли. В природе является также патогенном картофельных, злаковых, бобовой, яблонной и других видов тлей.

Конидии имеют светло-коричневую окраску, грушевидную форму с сосочками. При поверхностном культивировании гриб образует колонии светлого цвета с морщинистой поверхностью правильной формой. На поверхности колонии образуется белый налет конидиального спороношения.

Глубинная культура гриба образует в основном мицелиальные ростки, которые на 5 – 7-е сутки распадаются и образуют покоящиеся споры. Присутствие конидий в жидкой среде невелико – не более 10% спор. Обязательное условие хорошего роста – активная аэрация. Освещенность не влияет на рост и спорообразование гриба. Оптимальная температура от 22⁰С до 28⁰С. [1]

           2.2.Технологическая схема производства пириформина

Процесс производства пириформина включает в себя стадии:

· Коллекционно – поддерживающий пересев маточной культуры.

· Получение инокулюма

· Культивация

· Высушивание, фасовка, упаковка

· Стандартизация и контроль качества

   

                               

 

                          2.3.Сырье и материалы

Для приготовления питательной среды – соевая мука, глюкоза. Для поддержания маточной культуры – сусло пивное неохмеленное, агар микробиологический, дисцилированная вода. Материалы для производства пириформина: пробирки, марля, вата, бумага фильтровальная; для культивации качалка кругового вращения, колбы 1-3 литра или стеклянные емкости [1,5]

                           2.4.Оборудование и приборы

1. Термошкаф

2. Бактерицидные лампы

3. Холодильник

4. Качалка возвратно-поступательного движения

5. Мельница

6. Автоклав

7. Спиртовка

8. Иглы микробиологические

9. Спиртовка

10. Чашки Петри, колбы конические различной емкости 

                  2.5.Описание технологического процесса.

    Коллекционно – поддерживающий пересев и маточная культура.

Поддерживающие пересевы необходимы для содержания гриба в жизнеспособном состоянии. Культуру хранят в пробирках на косяках сусло-агара. [1:3]

                 Приготовление питательной среды суслоагар.

Пивное сусло разбавляют дистиллированной водой до концентрации сахара 5-7%. К разбавленному суслу прибавляют 1,5-2% агар-агара и, перемешивая, нагревают на медленном огне до его расплавления. Готовую среду фильтруют и разливают в пробирки.

Пробирки с суслом стерилизуют при 0,5 атм 30 минут, после застывания среды гриб пересевают иглой стерильно в пламени спиртовки. При этом иглой с загнутым концом, с помощью которой кусочек среды с культурой переносится в новую пробирку. Гриб растят 5 суток при температуре 26^±3⁰С, после чего пробирки закрывают полунепроницаемым материалом (целлофаном, калькой, фильтровальной бумагой), завязывают и хранят в холодильнике при 5…10⁰С до 6 месяцев.

Для работы следует применять культуру выращенную в чашках Петри. Для этого чашки Петри стерилизуют при 1 атм в течение часа, заполняют стерильной средой сусло-агара [1:3]. После застывания на поверхность среды, в центр чашки стерильно в пламени спиртовки иглой наносят кусочек культуры. Гриб растят пять суток при 26±3⁰С, культуру в чашках хранят в холодильнике до 2 месяцев. Для предотвращения высыхания среды чашки рекомендуется завернуть в плотную бумагу.

                                       Получение инокулята.

Для инокулята пригодна среда, обедненная углеводами: 1%соевой муки, 2%глюкозы. Колбы объемом 0,5-1,0 литра стерилизуют при 1 атм в течение 0,5 часа, заполняют средой на 1/5 часть, закрывают ватно-марлевыми пробками и снова стерилизуют при 0,5 атм 30 минут. В стерильную среду, когда она остынет, вносят кусочек культуры из чашки Петри возле пламени спиртовки. Культуру растят на качалке (скорость 150-240 об/мин) при температуре 26±3⁰С. За это время в среде образуются мицелиальные клубки, которые затее распадаются на короткие гифальные тела. Готовый инокулят содержит до 10⁵ гиф/мл среды.

Потребность инокулята для засева культуры – 5% от объема инокулируемой среды, стартовый титр при этом составляет от 10³ до 5х10³ гиф/мл.

                                         Культивация

Культивация проводится в ферментере. При его отсутствии несложно изготовить заменитель из стеклянной бутыли объемом 10 литров и более. Для хорошей аэрации по размеру горловины емкости изготавливается резиновая пробка, с тремя отверстиями. Одно отверстие (Ø20-30мм) необходимое для инокуляции, два других Ø 10-15 мм – для подачи и отсоса или кислорода. Посевное отверстие закрывается резиновой пробкой, к воздуходувным подводятся гибкие шланги по диаметру. Воздух подается и отсасывается через микробиологические фильтры для предотвращения заноса посторонней микрофлоры.

   Для культивирования готовится среда, состоящая из 1% соевой муки и 5% глюкозы. При использовании заменителей сои или глюкозы необходимо рН среды доводить до 7.

Выращивание в емкостях на качалке. Емкость стерилизуют при 1 атм в течение часа, заполняют средой на 1/5 часть объема, повторно стерилизуют при 0,5 атм 30 минут. В остывшую среду вносят инокулят в пламени горелки или в факеле. Культуру выращивают пять суток на качалке при 26±3⁰С.

К концу культивации в среде образуется до 10⁶ покоящихся спор/мл, которые являются основным действующим началом препарата. [1]

                          Высушивание, фасовка, упаковка.

Субстрат со зрелой массой гриба высыпают в пластиковые или эмалированные кюветы слоем не более 3 см и проводят сушку при 30…35⁰С, хорошей вентиляции и периодическим перемешиванием. Влажность готового препарата не должна превышать 8%.

Готовый препарат затаривают в мешки из крафт-бумаги. Каждый мешок маркируют с указанием номера партии, вида субстрата, даты изготовления препарата, титра, срока и условий хранения. Так же необходимо приложить инструкцию по применению пириформина [5]

 

         2.6. Контроль качества и стандартизация пириформина

Для определения количества жизнеспособных спор в готовом препарате используется два метода: прямой подсчет в камере Горяева и метод высева на твердую питательную среду в чашках Петри.

                        Определение титра в камере Горяева.

От каждой партии препарата отбирают 3-5 проб из разных мест по всей глубине и составляют общую пробу массой 70-100 г. Общую пробу тщательно перемешивают, после чего отвешивают навеску 10г с точностью 0,01г и переносят в колбу со 100 мл стерильной воды и стерильным крупнозернистым песком. Колбу закрывают стерильной пробкой и взбалтывают ее содержимое в течение 5 минут. Разведение препарата в приготовленной взвеси составляет 1:10 Параллельно готовят 7-9 пробирок, в каждую из которых добавляют по 9 мл дистиллированной воды, закрывают ватными пробками и стерилизуют. Затем готовят серию последовательных разведений. Для этого из колбы чистой пипеткой берут 1 мл суспензии и переносят в первую пробирку с 9 мл воды, получают разведение 1:100. Суспензию этого разведения тщательно перемешивают с помощью новой (чистой) пипетки, затем берут 1 мл полученного разведения и переносят его во 2 пробирку (разведение в 1000 раз). Для каждого нового разведения необходимо использовать отдельную стерильную пипетку

Камеру Горяева с хорошо притертым стеклом заполняют суспензией соответствующего разведения. Количество спор подсчитывают в 5 больших квадратах камеры (или в 20-100 малых квадратах), определяют среднее количество клеток в 1 малом квадрате и рассчитывают по формуле

  Х=N×4×10⁶,

Где Х – титр исследуемой суспензии клеток/1 мл

N – среднее количество клеток в одном малом квадрате

Для определения титра исходного препарата необходимо титр исследуемой суспензии умножить на соответствующее разведение.

 

      Определение титра методом посева на питательную среду

Готовят серию последовательных разведений как указанно в предыдущем методе. Из трех последних разведений, предварительно тщательно перемешанных, производят посев в чашки Петри на агаризованную среду Чапека или сусло-агар из расчета 1 мл суспензии на чашку. Этот объем распределяют по поверхности среды шпателем. Из одного разведения делают не менее 5 параллельных высевов. Для параллельных высевов из одного разведения можно пользоваться одной стерильной пипеткой и одним шпателем. Засеянные чашки помещают в термостат с температурой 23-25⁰С. Первый учет роста гриба проводят через 4-5 дней после посева, а затем через каждые 2-3 дня отмечают вновь появившиеся колонии антагониста. Титр препарата вычисляют по формуле:

Т=А+К

Где Т – титр препарата, спор/1г

  А – среднее число колоний, выросших при высеве из данного разведения (среднее арифметическое из 5 чаш Петри)

  К – разведение, из которого произведен высев.

При использовании чашечного метода все операции необходимо проводить в стерильном боксе [5].

 

                               2.7. Техника безопасности

При производстве пириформина следует соблюдать общие правила безопасности в микробиологических лабораториях

· При изготовлении суспензий необходимо пользоваться пипеткой с резиновой грушей

· При взятии навески или проб работу необходимо проводить в вытяжном шкафу

· Не допускать попадание живой культуры на кожу рук

· После окончания работы вымыть руки теплой водой с мылом

Кроме этого к работе допускаются лица прошедшие предварительный медицинский осмотр, инструктаж по технике безопасности и получившие письменное разрешение на право работы с биологическими агентами. Персонал должен быть обеспечен и систематически пользоваться спецодеждой:респиратором типа РУ-60 МА или ШБ-1 «лепесток», резиновыми перчатками, резиновым фартуком.

Во время обработок запрещено пить, курить, принимать пищу. [1,4,5]

 

                   2.8. Технико-экономический расчет

                                                                                                     Таблица 1

Перечень оборудования и материалов для получения пириформина

Наименование	Количество, шт
Для производства пириформина
Пробирки	Не менее 50
Вата и марля (для приготовления пробок)	-
Спиртовка	1
Иглы микробиологические	-
Чашки Петри	Не менее 50
Колбы конические 0,5-1 л	Не менее 50
Термошкаф (для культивирования и сушки препарата)	2
Бактерицидные лампы (для стерилизации помещения)	2
Холодильник для хранения культур	1
Качалка возвратно-поступательного движения (для роста инокулята)	1
Фильтрующий материал (полотно или бумажные фильтры)	-
Мельница	1
Автоклав	1
Для культивации
Качалка кругового вращения	1
Колбы 1-3 л или стеклянные емкости	Исходя из разрешающей способности качалки

 Нормы расхода ректификованного для стерилизации бокса и оборудования.

1. Обработка рук и инструментов – 10мл на 1 раз

2. Горение спиртовки 1ч – 130мл

3. Разовая обработка бокса и емкости – 50м

                    3. Проект биолаборатории

Для производства пириформина необходима биолаборатория. Производственная биолаборатория – специфическое и сложное хозяйство, в составе которого имеются здания или помещения, различное оборудование.

 

1. Рабочая комната – холодильник для хранения культур

2. Автоклавная – в данном помещении располагается автоклав для стерилизации среды.

3.4. Бокс с предбоксником – качалка кругового вращения.

5. Термостатная. Термостат для культивации гриба.

6. Комната для сушки биомассы – в данной комнате расположен термошкаф.

7. Моечная – мойка со столом.

8. Комната для размола биомассы – мельница для размола.

9. Комната для контроля качества.

10. Склад для хранения препарата. 

 

                                        Заключение

Биологические препараты играют ключевую роль в биологической защите от вредителей, болезней. Их использование относится и к оперативным и к фундаментальным способам воздействия на вредные организмы в агроэкосистемах. Как правило, применение биопрепаратов запускает механизмы экологически безопасной защиты растений. Воздействуя только на целевые мишени, биопрепараты обеспечивают активное участие других естественных регуляторов численности в подавлении фитофагов, фитопатогенов или сорных растений. Поэтому актуальной становится тема разработки новых биологических препаратов [5].

В данном курсовом проекте был разработан проект биолаборатории и технологическая карта производства биологического инсектицида – пириформина. Был произведен аналитический обзор литературы по данной теме, описана технологическая схема производства пириформина, был произведен технико-экономический расчет, а также были приведены сырье, материалы, оборудование и приборы для производства биопрепарата.

                                

                                  Список литературы

1. Производство и применение пириформина в защите овощей закрытого грунта от вредителей: Рекомендации/ВАСХНИЛ Сиб. отд-ние

НПО «Земледелие» - Новосибирск, 1989.-24с

2. Список пестицидов и агрохимикатов, разрешенных к применению на территории Российской Федерации 2009 г. Справочное издание, 320с.

3. Штерншис М.В., Джамилов Ф.С., Андреева И.В., Томилова О.Г./Биопрепараты в защите растений: Учебное пособие/Мин-во сельского хозяйства Р.Ф. Новосиб. Гос. Агроуниверситет – Новосибирск, 2000. – 128с.

4. Штерншис М.В. биотехнология в защите растений: учебное пособие/ Мин-во сельского хозяйства Р.Ф. Новосиб. Гос. Агроуниверситет – Новосибирск, 2001. – 156с.

5. Штерншис М.В. биотехнология в защите растений: учебное пособие/- 2-е изд., перераб и доп./Новосиб. Гос. Агроуниверситет – Новосибирск, 2006. – 2000с.

6. Штерншис М.В. регуляция численности вредителей с/х культур с помощью энтомопатогенов: Лекция/ Новосиб. Гос. Аграр. Ун-т. – Новосибирск, 1991г. – 60с.

7. Сельскохозяйственная энтомология/А.А. Мигулин, Г.Е. Осмоловский, Б.М. Лтвинов и др.; Под ред. А.А. Мигулина. – 2-е изд., перераб. и доп. – М.: Колос, 1983 – 416с., ил. – (Учебники и учебные пособия для высш. с-х. учеб. заведений)

8. Монастырский О.А. Биологизация защиты растений: отставание России становится все более очевидным//Защита и карантин растений, №11, 2004г – с.20-21