Интерфероновые диагностические тесты

Система интерферона (ИФН) обеспечивает противовирусную резистентность организма и влияет на весь комплекс его специфических и неспецифических защитных реакций.

Отражением функционального состояния системы ИФН является ИФН статус (1, 4), оценка которого проводится по нескольким показателям, основные из которых:

. Количество (активность) циркулирующего в крови ИФН (общий сывороточный ИФН).

. Уровень продукции ИФН -α/β лейкоцитами (или лимфоцитами) in vitro при его индукции вирусными индукторами (интерфероновая реакция лейкоцитов - ИРЛ).

. Уровень продукции ИФН -γ при его индукции митогенами в лейкоцитах (лимфоцитах) in vitro (2).

Исследование ИФН статуса позволяет определить количественные параметры физиологического интерферонового ответа у здоровых людей (1, 3, 5) и выявить интерферонодефицитные синдромы при острых, хронических, рецидивирующих инфекционных и аутоиммунных заболеваниях, первичных и вторичных иммунодефицитах (9, 11). Определение ИФН статуса достаточно информативно и может служить надежным клиническим ориентиром при диагностике, лечении и прогнозе исхода заболевания, как вирусной, так и невирусной этиологии.

Известен способ определения активности ИФН в сыворотке и плазме крови на основе торможения роста микроорганизмов в культуре. Однако данный метод не обладает достаточной чувствительностью и воспроизводимостью, не дает возможности выражения результатов в общепринятых международных единицах (ME), а также, выбора иммуномодулирующей терапии и прогноза исхода заболевания (МКИ 5 A 61 K 37/66, AC N 1082422, 1984 г.). Известен способ определения интерферонового статуса и прогноза исхода заболевания, включающий следующие стадии: кровь доноров или больных в объеме 1-1,5 мл берут из вены, добавляют гепарин, далее в 2 центрифужные пробирки вносят по 800 мкл Среды RPMI-1640, 100 мкл цельной крови, 100 мкл вируса болезни Ньюкасла (NDV) и фитогемагглютинин (ФГА) для индукции ИФН -α/β и ИФН -γ соответственно. Конечное разведение цельной крови в объеме 1 мл - 1/10. Оставшееся количество крови использовали для получения проб сывороточного ИФН. Индукцию ИФН -α/β и ИФН -γ проводили в течение 24 часов при 37^oC в атмосфере 5% CO₂. После инкубации пробы центрифугировали, надосадочную жидкость отсасывали. В пробах с индукцией синтеза ИФН -α/β лейкоцитами in vitro проводили инактивацию NDV инкубацией при pH до 2.0 в течение 2-3 суток при 4^oC с последующим восстановлением до рН 7.4. Пробы хранили при 4^oC до титрования. При постановке титрования микрометодом использовали 96-луночные микропланшеты. Для титрования использовали клетки линии М-19 (фибробласты человека). Каждую реакцию ставили в объеме 200 мкл с двумя повторами, общий расход цельной крови при этом составлял 200 мкл. В качестве тест-вируса использовали вирус везикулярного стоматита (ВВС), штамм Индиана. За единицу активности ИФН принимали величину, обратную его разведению, задерживающую деструкцию монослоя на 50%. У здоровых доноров уровень общего сывороточного ИФН соответствовал 2-8 ед/мл, индукция ИФН -α/β в культуре лейкоцитов равняется 1280 ед, ИФН-γ - 256 ед, при острой вирусной инфекции сывороточный ИФН равнялся 128 ед/мл, продукция ИФН -α/β - 10 ед, ИФН-γ - 64 ед. При хронической вирусной инфекции эти показатели составляли: сывороточный ИФН 32-64 ед/мл, продукция ИФН -α/β - 80 ед, ИФН -γ <2 ед. (Григорян С.С. Оценка интерферонового статуса людей по пробам цельной крови. Вопросы вирусологии, 1988, т. 3, N 4, с. 433-436).

Сущность изобретения состоит в том, что для анализа ИФН статуса в стерильные пробирки отбирают венозную кровь объемом от 0.5 до 5 мл. В часть пробирок предварительно вносится необходимое количество стерильного гепарина в виде концентрированного (для исключения разбавления исходного образца) раствора на среде RPMI - 1640 или на физиологическом растворе, так, чтобы конечная концентрация гепарина составила 10-15 ед/мл. Отобранная таким образом кровь может храниться 5-6 часов при 4^oC без потери всех необходимых свойств.

Цельную негепаринизированную кровь центрифугируют 10-15 мин при 1000 g, после чего в стерильный эппендорф отбирают 50-200 мкл сыворотки для анализа содержания общего сывороточного ИФН. Для типирования ИФН в сыворотке крови (ИФН -α, ИФН -β, ИФН -γ) образцы инкубируются с моноклональными антителами (MAT) к различным типам ИФН в течение 1 часа при 37^oC. Содержание ИФН каждого типа определяют, исходя из активности общего сывороточного ИФН и величины падения активности ИФН в каждом образце после инкубации с МАТ. Образцы хранят при -25^oC.

Для определения содержания кислотолабильного ИФН -α в сыворотке крови в исследуемые образцы добавляют раствор 0.1 н. HCl до pH 2.0, образцы инкубируют в течение 1 часа при 37^oC, после чего pH доводят до 7.4 добавлением 0.1 н. NaOH. Параллельно с этим, другую аликвоту исследуемого образца инкубируют с МАТ к ИФН -γ 1 час при 37^oC для осаждения сывороточного ИФН -γ. Содержание кислотолабильного ИФН -α определяют как разность активностей образца, инкубированного с МАТ к ИФН -γ, и образца, инкубированного при pH 2.0. Образцы хранят до анализа при -25^oC.

Для определения уровня продукции различных типов ИФН лейкоцитами крови in vitro в стерильные эппендорфы вносят среду RPMI-1640 с добавлением глутамина, антибиотиков (пенициллин, стрептомицин до 100 ед/мл), 2% сыворотки КРС, растворы индукторов ИФН (5-7 lg ЭИД₅₀ NDV для ИФН -α/β) и энтеротоксин St. aureus (СЭА, 10 мг/мл) для ИФН - и цельную гепаринизированную кровь в соотношении 8/1/1 (например, 100 мкл PRMI-1640, 12.5 мкл раствора индуктора ИФН и 12.5 мкл цельной крови). Для определения уровня спонтанной продукции ИФН вместо раствора индуктора вносят эквивалентный объем питательной среды. Полученную индукционную смесь инкубируют 24 часа при 37^oC, затем в эппендорфы, в которых производится индукция ИФН -α/β, добавляют 0.1 н. раствор HCl до pH 2.0, пробы инкубируют 1 час при 37^oC, после чего в них вносят 0.1 н. раствор NaOH до pH 7.4. Таким же образом обрабатывают пробы спонтанно продуцированного ИФН, в которых определяют содержание ИФН -γ по падению активности ИФН в закисленной / восстановленной пробе (ее активность соответствует активности спонтанно-продуцируемого ИФН -α/β) по сравнению с обычной. Обработанные таким образом пробы с индуцированным и спонтанно продуцированным ИФН хранятся до анализа при -25^oC. Непосредственно перед анализом пробы, подвергшиеся закислению / восстановлению (индуцированный и спонтанный ИФН ИФН -α/β, центрифугируют 10-20 мин при 3000-4000 g для осаждения коагулированных макромолекул.

При определении индуцированной продукции кислотолабильного ИФН-γ, индукцию его синтеза проводят в тех же условиях и параллельно индукции общего ИФН -α/β с той разницей, что вместо закисления / восстановления после инкубации и NDV образцы инкубируют с поликлональной сывороткой к NDV 1 час при 37^oC. Обработанные таким образом пробы центрифугируют при 4000-7000 g для осаждения NDV и хранят до анализа при -25^oC.

Определение активности ингибиторов / активаторов действия ИФН в физиологических жидкостях производят совместным титрованием исследуемого образца на фоне постоянной концентрации референс - препарата ИФН при прочих условиях, соответствующих обычному титрованию (см. ниже). Активность ингибиторов / активаторов действия ИФН определяют по отношению активности стандартного препарата ИФН к активности стандартного препарата той же концентрации в присутствии исследуемой сыворотки крови и выражают как коэффициент стимуляции. Образцы физиологических жидкостей (сыворотка крови, цереброспинальная, синовиальная и пр. жидкости) аликвотируют и хранят до анализа при -25^oC.

Активность ингибиторов / активаторов синтеза ИФН в физиологических жидкостях определяют следующим образом: в индукционную систему контрольных проб, аналогичную таковой для оценки индуцированной продукции ИФН, вносят стандартные индукторы ИФН -α/β и ИФН -γ (NDV и СЭА соответственно) и, вместо цельной крови, клетки линии Namalva (до концентрации 10⁶ кл/мл) в эквивалентном объеме. Опытные пробы, кроме этого, содержат раститрованные образцы исследуемых физиологических жидкостей. Индукцию синтеза ИФН проводят при тех же условиях и количественных соотношениях компонентов, как при определении индукции ИФН -α/β и ИФН -γлейкоцитами in vitro. По соотношению активностей ИФН в опытных и контрольных пробах определяют активность ингибиторов / активаторов синтеза ИФН в исследуемых образцах как коэффициент стимуляции / ингибирования синтеза ИФН in vitro. После индукции пробы замораживаются и хранятся до анализа при -25^oC.

Определение чувствительности естественных потенциальных продуцентов ИФН (лейкоциты крови) к применяемым в медицинской практике и экспериментальным лекарственным препаратам проводится при тех же условиях, как и определение индуцированной продукции ИФН лейкоцитами in vitro. При этом, вместо стандартных индукторов ИФН (NDV и СЭА) используют препараты, чувствительность к которым определяют. Оценивают влияние интересующего препарата на процессы продукции ИФН клетками донора in vitro. Чувствительность к препарату считают положительной, если активность ИФН в пробе на чувствительность в 1.5 и более раза выше общей активности спонтанно-продуцируемого лейкоцитами ИФН. Методически данный тест повторяет тест на индуцированную продукцию ИФН -α/β и ИФН -γ лейкоцитами in vitro с соблюдением всех соответствующих условий. Подготовленные таким образом пробы хранят до анализа при -25^oC.

Анализ активности ИФН в подготовленных вышеописанными методами пробах проводят с помощью титрования исследуемых проб в 96 - луночных микропланшетах над монослоем клеток перевиваемых культур (L-41, Нер-2, A-549, MG-63, L-929), инкубации 24 часа при 37^oC в атмосфере 5% CO₂, последующей инкубации в тех же условиях в присутствии 100 ЦПД₅₀ вируса везикулярного стоматита (ВВС), штамм Индиана. После этого, для стандартизации и автоматизации учета результатов анализа микропланшеты окрашивают 5-10 мин 0.1% раствором кристаллического фиолетового на 30% этаноле, отмывают и высушивают на воздухе. Дальнейший учет результатов проводят либо визуально, либо автоматически с помощью ридера для иммуноферментного анализа, растворением окрашенного монослоя клеток 2% раствором додецилсульфата натрия на 5% глицерине (или экстракцией 30% этанолом 1 час при 37^oC) и измерением оптической плотности полученных растворов при длине волны 570-590 нм.

Активность ИФН в анализируемом образце определяется с помощью калибровочной кривой зависимости (% сохранившихся клеток)/(активность стандартного препарата ИФН) для визуального учета или (оптическая плотность)/(активность стандартного препарата ИФН). Это дает возможность выражать результаты анализа в стандартных (международных) единицах (ME), а также значительно повысить точность получаемых результатов до 0.5 ME. Учет проводится по той титровочной точке, в которой сохранилось 30-50% клеток от исходного числа (при визуальном учете) или по точке, оптическая плотность которой лежит в интервале 0.2-0.7 ед оптич. плотности (при автоматическом учете).

Приведенный комплекс показателей представляет собой полный вариант анализа ИФН статуса. На практике бывает достаточно использовать три основных показателя: задержание общего ИФН сыворотки крови (sИФН), продукция ИФН -α/β и ИФН -γ лейкоцитами крови при индукции in vitro.

В норме, содержание в крови sИФН соответствует диапазону 0-10 МЕ/мл, продукция ИФН -α/β 250-520 ME, ИФН -γ110-250 ME. Низкое содержание ИФН в сыворотке крови сочетается с высокой потенциальной способностью к продукции различных типов ИФН.

При содержании sИФН 25 МЕ/мл, продукции ИФН -α/β 110, ИФН -γ 55 прогнозируют благоприятный исход при остром течении заболевания, поскольку система ИФН адекватно реагирует на патологию выбросом достаточного количества ИФН. Действию естественных механизмов защиты не препятствует этиотропная терапия (антибиотики, химиопрепараты), с которой целесообразно сочетать препараты ИФН (виферон и др.) для предотвращения развития ИФН- и иммунодефицитов и усиления эффективности лечения. Применение индукторов ИФН малоэффективно (система ИФН не в состоянии ответить на дополнительную стимуляцию синтеза ИФН). Назначение препаратов ИНФ позволит компенсировать возможный дефицит активности систем защиты, что приведет к повышению способности к продукции ИФН -α/β и ИФН -γ, и, в дальнейшем, позволит эффективно применять индукторы ИФН и иммуномодуляторы микробного происхождения.

При содержании sИФН >35, продукции ИФН -α/β 60, ИФН -γ<30 прогнозируют тяжелое острое протекание заболевания, требующего срочного терапевтического вмешательства. От применения иммуномодулирующей терапии лучше воздержаться до стабилизации состояния пациента.

При содержании sИФН 12-25 МЕ/мл, продукции ИФН -α/β 85-250 ME, ИФН -γ 45-110 ME прогнозируют подострый характер протекания заболевания и высокую вероятность хронизации, поскольку реакция системы ИФН недостаточна для обеспечения защиты организма. Назначают иммуностимулирующие препараты (индукторы ИФН, препараты микробного происхождения, полимерные препараты: циклоферон, неовир, пирогенал, ликопид, полирем и др.). Для усиления их эффекта их комбинируют с препаратами ИФН (виферон) по схемам: 1-й день виферон (2 приема по одной свече 150000 - 1000000 ME), 2-й день индуктор ИФН (циклоферон, неовир - 1 инъекция, 2 мл 12.5% р - р) и т.д. в течение 20-30 дней; 1-2 10-дневных курса виферона (2 раза в день через 10-12 часов по 1 свече 150000 - 1000000 ME, перерыв между курсами 5-7 дней) и через 5-7 дней 1-2 курса индукторов ИФН (циклоферон, неовир, по 1 инъекции 2 мл 12.5% р-ра на 1, 2, 4, 6, 8 дни, перерыв между курсами 5-7 дней). Чем выше sИФН и ниже продукция ИФН -α/β и ИФН -γ (острее протекание заболевания), тем более показаны препараты интерферона (виферон). Наибольшая эффективность достигается при 1-2 курсах виферона и, затем, сочетании виферона и индукторов ИФН по вышеприведенной схеме.

При содержании sИФН 0-10 ME, продукции ИФН -α/β <40 ME, ИФН-γ <20 ME делают неблагоприятный прогноз исхода заболевания. Для компенсации ИФН- и иммунодефицита назначают иммунозаместительную терапию: препараты ИФН (виферон), гамма-глобулина, интерлейкинов (ронколейкин) и других препаратов, содержащих экзогенные защитные факторы. Использование препаратов этой группы может предварять назначение антибиотиков и химиопрепаратов или они могут применяться совместно. При повышении резервов системы (повышение способности к продукции ИФН -α/β и ИФН -γ) продолжают этиотропное лечение в сочетании с иммуномодулирующим (при этом в лечебные схемы уже можно включать и препараты иммуностимулирующего ряда - индукторы ИФН, полимеры микробного происхождения и др.). Также возможно и комбинирование различных видов иммунокорригирующих воздействий. При дальнейшей стабилизации состояния продолжают этиотропное и патогенетическое лечение.

При содержании sИФН 12-40 МЕ/мл, продукции ИФН -α/β 60-400 МЕ и значительно повышенной продукции лейкоцитами ИФН-γ (свыше 250 ME) прогнозируют развитие нейроиммунной патологии (рассеянный склероз и др.), назначают препараты ИФН -β (бетаферон) в комплексе с традиционными методами лечения.

Заключение

В целом, учитывая все «за» и «против» интерферонов, можно утверждать, что эта группа белков вступила в пору зрелости, разумного и взвешенного к ним отношения. Нет сомнения, что интерфероны еще долго будет служить прекрасной моделью для биологических исследований и одновременно широко использоваться как высокоэффективные лекарственные средства при разных формах патологии.