Определение содержания гемоглобина

Определение содержания гемоглобина в крови животных является одним из самых важных и массовых показателей. Для определения гемоглобина чаще всего анализируют производные гемоглобина, образовавшиеся в процессе его окисления и присоединения к гену различных химических групп, приводящих к изменению валентности железа и окраски раствора [3].

Для рутинных лабораторных исследований наиболее предпочтительны колориметрические методы, как наиболее дешевые, простые и быстрые в исполнении. Кровь животного – это нормальная смесь производных гемоглобина с различными спектрами поглощения. При количественном определении гемоглобина колориметрическими методами возникает проблема в выборе реагента, который превращал бы все производные гемоглобина только в одну форму перед фотометрическим анализом. Лучшими методами, количественно превращающими гемоглобин в его производные, оказались гемиглобинцианидный (HbCN), гемихромный (HbChr) и гемиглобиназидный (HbN3), которые при фотометрировании дают наименьшую ошибку определения среди других методов анализа [1].

Повышение: некоторые формы гемобластозов, в частности эритремия, обезвоживание организма.

Понижение (анемия): различные виды анемий, в том числе вследствие кровопотери.

Принцин гемиглобинцианидного метода основан на переводе всех форм гемоглобина в одну – гемиглобинцианид. Перевод гемоглобина в гемиглобинцианид осуществляется при его взаимодействии с трансформирующим раствором, содержащим феррицианид калия, цианид калия, дигидрофосфат калия и неионный детергент. Дигидрофосфат калия поддерживает уровень рН, при котором реакция проходит за 3–5 минут. Детергент усиливает гемолиз эритроцитов и предотвращает мутность, связанную с белками плазмы. Феррицианид калия окисляет все формы гемоглобина в метгемоглобин, который образует с цианистым калием гемиглобинцианид, имеющий красноватый цвет, интенсивность окраски которого прямо пропорциональна концентрации гемоглобина в пробе.

Принцип гемихромного метода основан на переводе всех форм гемоглобина в одну – гемихром. При взаимодействии гемоглобина с трансформирующим раствором, содержащим жирные кислоты с феррицианидом калия или додецилсульфат натрия, происходит его превращение в окисленную низкоспиновую форму – гемихром (HbChr), имеющую красноватый цвет, интенсивность окраски которого прямо пропорциональна концентрации гемоглобина в пробе.

При широкомасштабных испытаниях гемихромного метода было показано, что в интервале концентраций гемоглобина от 40 до 200 г./л калибровочные графики гемиглобинцианида и гемихрома представляют прямую линию, выходящую из начала координат, а близкие углы наклона прямых указывают на сопоставимость обоих методов.

При определении гемоглобина двумя методами Ахрем А.А. с соавторами показали, что большую точность (и меньшую s) дает гемихромный метод. Авторы предполагают, что SDS способствует солюбилизации мембранных частиц и препятствует адсорбции белка на стекле пробирок и кювет, тем самым обеспечивается высокая точность анализа [7].

Сравнительная оценка результатов определения гемоглобина в крови двумя методами показала, что результаты сопоставимы, а коэффициент корреляции методов составляет 0,99. Таким образом, гемихромный метод определения гемоглобина в крови обладает всеми достоинствами гемиглобинцианидного метода, которые дополняются отсутствием в составе трансформирующего реагента высокотоксичных цианидов и других ядовитых веществ.

Выполнение. В сухие чистые пробирки дозатором внести по 5 мл трансформирующего раствора, к ним прилить по 20 мкл крови поверенной пипеткой Сали или механическим дозатором со всеми предосторожностями, перечисленными в предыдущем разделе. Пробу тщательно перемешать на микровстряхивателе или вручную до достижения гомогенного раствора. Растворы выдержать при комнатной температуре время, указанное в инструкции к набору, и измерить оптическую плотность растворов на поверенном, калиброванном приборе в кювете, имеющей нулевое поглощение дистиллированной воды относительно аналогичной контрольной (с длиной оптического пути 10 мм). Окраска растворов устойчива до 5 час и более, что позволяет проводить измерения в любое удобное время в этом временном интервале. Расчет содержания гемоглобина в крови произвести по калибровочному графику или фактору, определенному на данном приборе. Если соблюдены все перечисленные условия подготовки и проведения анализа, описанные выше, погрешность определения гемоглобина в крови не будет превышать ±2%. Кратко суммируем источники возможных ошибок при определении гемоглобина: использование некалиброванных пипеток и несовершенная техника дозирования проб крови; применение неповеренного оборудования, не обеспечивающего линейную зависимость оптической плотности от концентрации гемоглобина в требуемой области измерений; нестабильность прибора; отсутствие внутрилабораторного контроля качества; недостаточная чистота кювет, особенно проточных; ошибки при построении калибровочных графиков и расчете факторов; использование контрольных растворов гемоглобина низкого качества; ошибки оператора, ошибки, допускаемые на преаналитической фазе [6].