Фрагменты гемоглобина из кости тиранозавра (Tyrannosaurus rex)

В 1990 г. в восточной части штата Монтана выкопали останки тиранозавра. Почти сразу же (возможно, под влиянием фильма С. Спилберга), на Биологическом факультете университета штата Монтата, в г. Бозмене (Bozeman), США, началось исследование его костей в аспекте молекулярной палеонтологии. Работы проводились в группе ассистента профессора, доктора биологических наук (Ph.D.) Мэри Швейцер (Mary Higby Schweitzer). Руководителем лаборатории являлся (и является до сих пор) профессор Джек Хорнер.

Если посмотреть в Интернете страничку, посвященную сведениям о докторе М. Швейцер [40], то на фото перед вами предстанет симпатичная и жизнерадостная особа, имеющая, несмотря на свой не очень-то значительный возраст, солидный послужной список и, по-видимому, высокую профессиональную квалификацию. Именно доктор Мэри может ныне считаться, полагаю, одним из ведущих мировых исследователей в области молекулярной палеонтологии.

Программная экспериментальная работа, посвященная изучению макромолекул в кости тиранозавра, опубликована в трудах АН США и, как все статьи этого издания, полностью помещена в Интернете (Schweitzer M.H. et al., 1997) [8]. Последнее позволяет углубленно ознакомиться со всеми методическими тонкостями и выводами авторов без посещения специальной библиотеки. Специалисту видна тщательность при выполнении экспериментов, адекватность методов и достоверность полученных результатов.

Хотя нашей задачей не является рассмотрение узких специальных вопросов биохимии и иммунохимии, все же придется разъяснить, что сделано и как. Иначе будет непонятно, да и слишком важна проблема.

Из участка кости с видимыми под микроскопом сосудистыми стенками провели экстракцию белкового материала. Такового было получено, с позиций биохимика-аналитика, ощутимое количество — порядка 1 мг. Фрагменты распавшихся белков (полипептиды и пептиды) явно имели небольшой размер, поскольку, как указывают авторы, они не идентифицировались при электрофорезе в денатурирующих условиях [8]. Последний метод — это стандартный подход при разделении белковых смесей в соответствии с их молекулярной массой, и белки хорошо видны на электрофореграмме (при стандартных условиях опыта), только когда они имеют молекулярную массу не менее 6.000–10.000 "углеродных единиц" (вспомним школьную химию: углеродная единица — это 1/12 от массы обычного нам изотопа углерода 12C). Масса средней аминокислоты (всего их 22) составляет 140 у.е. (от 89 до 240 у.е.; большинство 120–150 у.е.). Следовательно, чтобы белок был хорошо "виден" при электрофорезе, он должен состоять из 40–70 аминокислот. Но в белковом экстракте из кости тиранозавра такие полипептиды не обнаруживались, следовательно, фрагменты оказались меньшими.

Априори было ясно, что основную часть должны составлять фрагменты именно гемоглобина — наиболее "обильного" белка крови (сравним только альбумин) — ведь экстрагировали те участки кости, где локализовались видимые под микроскопом стенки сосудов.

Далее авторы иммунизировали белковым экстрактом крыс. Обычно иммунизируют кроликов или морских свинок (у последних иммунный ответ сильнее, а от кроликов — больше материала), но в данном случае, в связи с малым количеством белкового экстракта, пришлось, наверное, выбрать крыс, которые меньше кроликов и свинок.

Иммуноген (экстракт) вместе с адъювантом Фрейнда (стандартный способ усилить иммунный ответ) вводили двум крысам, и у обеих выработались антитела (последнее указывает, что иммуногенность была достаточно стабильна; значит, фрагменты не являлись совсем уж ничтожными). Хорошо известно, что степень иммуногенности (т.е. способность вызывать выработку антител у животных) очень зависит от размера белковой или пептидной молекулы. Невозможно выработать антитела против фрагмента белка с молекулярной массой менее 1000, т.е. состоящего из порядка 7–8 аминокислот (см., например, [41]).

Однако авторы не просто получили "какой-то" иммунный ответ. Не это было их задачей. Они использовали антисыворотку крови крыс для дальнейших иммунохимических методов определения. Отсюда следует, что уровень антител в сыворотке был достаточно высок (иначе методы бы не сработали), а такое может быть обеспечено, только если фрагменты белка имели молекулярную массу значительно более 1000.

Думаю, что ни один специалист (даже иммунохимик) не скажет, какие точно минимальные размеры фрагментов белка при иммунизации необходимы, чтобы антисыворотка имела "рабочий вид". Он скажет, что иммуногенность зависит от конкретного типа белка, от конкретного типа фрагментов (она связана и с аминокислотным составом), от конкретных животных и т.п. Здесь просто голая эмпирика, можно сказать, почти ремесло: кто дольше работал и с бóльшим количеством белков, тот и способен дать более правдоподобный ответ. Тем более, что на практике редко получают антисыворотку к столь малым молекулам, поскольку таких белков в живом организме просто мало.

Ваш покорный слуга, хотя и получал антисыворотку и делал аналогичные вещи в области определения белков иммунохимическими методами, все-таки не является конкретно иммунохимиком. И тем не менее позволю себе сделать следующий вывод. Чтобы антисыворотка к каким-то белковым фрагментам, выделенным из той кости тиранозавра, "работала" так, как это наблюдалось у авторов [8], она все-таки должна была иметь ощутимый титр (концентрацию) антител. Поэтому и иммуногенность вводимых крысам полипептидов была достаточно ощутима, а, значит, и их молекулярная масса (длина молекулы) — тоже. Полагаю, что величина последней составляла никак не менее 2000–3000 у.е., что соответствует цепочке из порядка 15–20 аминокислотных остатков.

Указанный вывод косвенно следует в том числе и из руководств по иммунохимическим методам анализа (например [42]).

Далее авторы [8], использовав полученную антисыворотку, с помощью двух иммунохимических методов определили, реагирует ли она с препаратами гемоглобинов (коммерческих, выпускаемых химическими фирмами) из различных источников. При иммуноферментном анализе в растворе (ELISA) было обнаружено, что антисыворотка отчетливо "узнает" гемоглобин индюка, а с помощью иммуноблоттинга (это на специальной мембране) получены еще более исчерпывающие данные.

В [8] проделаны все стандартные контроли и представлен почти весь первичный экспериментальный иллюстративный материал. Перед иммуноблоттингом авторы убедились, что имеющиеся у них стандартные препараты гемоглобинов кролика, индюка и змеи вполне качественные. Действительно, хотя и закупленные, наверное, на крупных химических фирмах (в статье не указано, но вряд ли сами очищали), такие препараты могут портиться при хранении даже в холодильнике (микробы съедят, вода попадет). Это вам не доказывать, что выделенным не распавшимся фрагментам белка тиранозавра миллионы лет. Попробуй не убедись, что твои стандартные препараты современных белков не развалились у тебя (частично, конечно) при хранении в течение нескольких лет, или же при неаккуратной транспортировке с фирмы (когда лед положить забыли), и коллеги-биохимики могут указать на возможность некорректности и артефактов, посмотрев полученные тобой данные.

Это только у тиранозавра его полипептиды десятки миллионов лет нераспадаться способны.

Как бы там ни было, перед иммуноблоттингом авторы провели электрофорез своих стандартных гемоглобинов (электрофореграмма представлена) и убедились, что все они имеют присущую гемоглобинам молекулярную массу (порядка 64.000), то есть, что препараты "не развалились".

После этого проводили их иммуноблоттинг с антисывороткой к белковому экстракту из кости тиранозавра и обнаружили отчетливую (во всяком случае, на фото) реакцию с гемоглобинами кролика и индюка. А вот с гемоглобином змеи антитела не реагировали, и это послужило контролем того, что антитела связываются не с любым белком. Если бы антитела "узнали" еще и гемоглобин змеи, то авторам пришлось бы для контроля исследовать реакцию с еще каким-нибудь белком, не гемоглобином (с альбумином, к примеру). Чтобы сказать: да, реакция характерна не просто для белков как таковых, а именно и только для гемоглобинов.

Но в молекуле гемоглобина змеи не оказалось того участка аминокислотной последовательности, который соответствовал фрагментам гемоглобина тиранозавра, в то время как в гемоглобинах индюка и кролика он имелся. Антитела не среагировали с гемоглобином змеи, и, поэтому, авторам повезло: не пришлось проводить дополнительное исследование реакции с каким-нибудь другим, неспецифическим белком. В качестве его случайно выступил гемоглобин змеи.

С первого взгляда кажется странным: антитела к белку тиранозавра, а реагируют с гемоглобином кролика, но не змеи. Но это и не важно: просто такой участок полипептидной последовательности во фрагментах весьма распавшегося гемоглобина тиранозавра попался, которого нет в белке змеи. Тем более, что он имеется в гемоглобине птицы (индюка), а именно к птицам ящеры типа тиранозавра и близки [10, 11].

Авторы [8] проделали также иммуноблоттинг с экстрактами из бактерий и даже из окружавшего кость песчаника, но антитела со всем этим, конечно, не среагировали. Таким образом, почти все мыслимые контроли были соблюдены.

Однако идентификацией белковой части фрагментов гемоглобина тиранозавра М. Швейцер с соавторами похвально не ограничились. В состав молекулы гемоглобина входит специфичное молекулярное образование — гем: железо в особой координационной форме в связи с порфирином (это кольцевая структура; грубо говоря, что-то типа нескольких бензолов). Авторы [8] для идентификации специфической структуры гема в экстрактах из костей динозавра применили целый комплекс из пяти физико-химических методов: ЯМР, спектроскопию в ультрафиолете, ЭПР, HPLC и др. (не станем подробно рассматривать суть этих известных методов). Было обнаружено, что во всех случаях полученные показатели характерны для гема.

Кроме того, в местах локализации структур, соответствующих сосудам внутри костей, окраска была характерной для остатков крови (красно-коричневая). Такую же окраску имел и белковый экстракт [8, 16].

Это все, но этого вполне хватает, чтобы сделать следующие выводы:

1) Работа проведена корректно; использованные подходы адекватны, а полученные данные убедительны.

2) Найдены остатки специфичной структуры гема в участках сосудистой стенки кости тиранозавра.

3) Строго идентифицированы белковые фрагменты молекулы именно гемоглобина тиранозавра возрастом "65 млн. лет".

4) Эти фрагменты, хотя и малы, вряд ли состоят из менее чем 15–20 аминокислотных остатков, что составляет 3–5% от интактной (исходной) молекулы гемоглобина. В самом теоретически "худшем" случае фрагменты не могут включать менее 7–8 аминокислот (2% от интактной молекулы), но этот случай весьма проблематичен, исходя из их ощутимой иммуногенности. В наиболее же "лучшем" теоретически случае фрагменты не могут быть длиной более 40–70 аминокислот (10–15% от интактного белка), поскольку не видны при электрофорезе.

Таким образом, гемоглобин тиранозавра за "65 млн. лет" почему-то не распался на все 100%, а только максимум на 95–98%. Что же это за такой, по-видимому, никому неизвестный сверхустойчивый полипептидный участок входит в его состав? Новое слово в науке о гемоглобине и в науке о тиранозаврах.