Методы генной инженерии

К методам прямого переноса чужеродной ДНК в протопласты растений и животных относится электропарация: кратковременные электрические разряды (1—100 мкс при напряженности поля 1000—10000 В/см2) увеличивают проницаемость мембран протопластов, куда и проникает находящееся в растворе ДНК. Так были получены трансформанты кукурузы, риса и сахарного тростника. В MCXA разрабатывается метод введения чужеродной ДНК с использованием электрофореза в агаровом геле. Показана возможность применения данного метода для трансформации каллусов пшеницы с последующей регенерацией из них трансгенных растений.

Оригинальный способ введения чужеродной ДНК в злаки разработан в Корнельском университете США. С помощью генетического пистолета в клетки растений выстреливают крохотные вольфрамовые шарики, покрытые генетическим материалом. Например, способ баллистической трансформации применили для введения гена вируса табачной мозаики в клетки лука. Была установлена экспрессия гена в клетках (Уайк, 1988). Метод высокоскоростной баллистической трансформации в настоящее время широко используется в Центре "Биоинженерия", ИМГ, ИФР. ВНИИСБ при создании трансгенных растений пшеницы, кукурузы, подсолнечника, плодовых.

Нерешенные проблемы генной инженерии.

   Одной из самых значительных трудностей генной инженерии является введение в геном больших генов или нескольких функциональных генов. Это связано с емкостью векторов для трансформации. Гены, в особенности эукариотические значительны по размеру(5-15 т.н.п.), но они все чаще используются для трансформации растений. Но кроме выбранного гена векторные конструкции должны содержать в себе селективные гены. В некоторых случаях для укорачивания конструкции используют кДНК последовательности. Однако кДНК комплексы не всегда приемлемы из- за специфики сплайсинга in vivo.

Лимитирующим фактором для трансформации растений может быть и то, что необходимый признак кодируется несколькими генами, и получение трансгенных растений обладающих такими признаками пока технически не выполнимо.

Отдельно стоит проблема, возникающая при экспрессии чужеродного гена. Часто после двух - пяти поколений активно транскрибирующийся ген, перестает экспрессироваться. Чаще всего инактивация трансгена происходит из-за метилирования регуляторных последовательностей, либо возможна репрессия в результате взаимодействия с промотором каких-то белков. Активировать такой выключенный трансген не представляется возможным. Спрогнозировать данную ситуацию довольно-таки трудно, так как она зависит от ряда факторов, в том числе и от последовательности самого белка и конкретном месте интеграции его в геном растения. Преодолеть это вероятно в какой-то мере возможно путем получения многократной трансформации и получения различных линий, несущих одинаковую векторную конструкцию с различными местами интеграции в геном растения.

Одной из самых главных причин сдерживающих интенсивность и эффективность работ по трансгенезу остается крайне слабое развитие исследований по идентификации эффективных генов, созданию банков генов и ограниченная научная база генетической инженерии, что связано с крайне слабой финансовой поддержкой в нашей стране генной инженерии, как важнейшего приоритета XXI  века.

Клеточная селекция.

  Более широкое практическое применение в настоящее время получило другое важнейшее направление современной биотехнологии — клеточная селекция как метод создания новых форм растений путем выделения мутантных клеток и сомаклональных вариаций в селективных условиях.

 Клеточная селекция является как бы развитием мутационной селекции, но реализуется на уровне единичных клеток с использованием техники in vitro, что придает ей, с одной стороны, более широкие возможности, а с другой стороны — создает значительные трудности из-за необходимости регенерации из отдельных клеток полноценных. Преимущество клеточной селекции перед традиционными методами состоит в отсутствии сезонности в работе, возможности использования миллионов клеток при отборе, направленности селекции путем применения селективных сред и выполнении работ в лабораторных условиях.

С развитием культуры in vitro появилась реальная возможность более широкого использования гаплоидии в селекции сельскохозяйственных культур. Применение метода культуры клеток позволило осуществить регенерацию растений из генеративных клеток, содержащих гаплоидный набор хромосом. Стало возможным массовое получение гаплоидов. Практическое значение в селекции в настоящее время получили культура пыльников (андрогенез), завязей и семяпочек (гиногенез) и метод гаплопродюсера, который является разновидностью гиногенеза Keller et al., 1987).

В Селекционно-генетическом институте (г. Одесса, бывш. ВСГИ) методом гаплопродюсера были созданы первые два отечественные сорта ячменя Исток и Одесский 115. Сорт Одесский отличался повышенной продуктивностью и устойчивостью к болезням и был признан перспективным в ряде областей (Ново-лоцкий, 1986). В последующем этим методом были получены засухоустойчивые сорта Прерия и Степной дар (Новолоцкий, 1997). Срок выведения сортов ячменя при использовании гаплоидной селекции сокращается на 4—6 лет.

При изучении растений, регенерированных из соматических клеток в культуре in vitro, было установлено, что они генетически не всегда однородны. Эту, так называемую, сомаклональную изменчивость, как источник полезных мутаций стали использовать в селекции растений. У регенерантов в отличие от индуцированных мутантов редко наблюдается мозаичность, что является результатом их происхождения из единичной клетки, и поэтому сомаклоны могут быть стабилизированы в течение одного поколения.