Витальное (прижизненное) изучение клеток

Билет № 1

1) Гистология — это наука, изучающая закономерности развития, строения и функции тканей, а также межтканевые взаимодействия, в историческом и индивидуальном развитии человека и многоклеточных организмов. Объект гистологии — ткани — представляют собой филогенетически сложившиеся, топографически и функционально связанные клеточные системы и их производные, из которых образованы органы. Гистология подразделяется на общую гистологию, которая изучает основные принципы развития, строения и функции клеток и тканей, и на частную гистологию, изучающую структуру и функции тканевых комплексов в составе органов тела многоклеточных организмов.

Организмы человека и животных являются целостными биологическими системами, в которых условно можно выделить несколько взаимосвязанных, взаимодействующих и соподчиненных уровней организации — молекулярный, субклеточный, клеточный, тканевый и органный. Каждый из этих уровней обладает известной автономностью и включает структурные единицы нижележащих уровней. Организменный уровень — собственно организм — формируется как целостная биологическая система в процессе индивидуального развития, именуемого онтогенезом. Органный уровень включает комплекс взаимодействующих тканей в процессе выполнения ими функций, свойственных данному конкретному органу или системе органов. Тканевый уровень объединяет клетки и их производные. В состав тканей могут входить клетки различной генетической детерминации, однако основные свойства тканей определяются ведущими клетками. Клеточный уровень представлен основной структурно-функциональной единицей ткани — клеткой и ее производными. Субклеточный уровень включает структурно-функциональные компоненты (компартменты) клетки — плазмолемму, ядро, цитозоль, органеллы, включения и др. Наконец, молекулярный уровень характеризуется молекулярным составом клеточных компонентов и механизмами их функционирования.

2) Сердце — центральный орган системы крово- и лимфообращения. Благодаря способности к сокращениям, сердце приводит в движение кровь. Стенка сердца состоит из трех оболочек: эндокарда, миокарда и эпикарда. Эндокард. Во внутренней оболочке сердца различают следующие слои: эндотелий, выстилающий изнутри полости сердца, и его базальную мембрану; подэндотелиальный слой, представленный рыхлой соединительной тканью, в которой много малодиффе-ренцированных клеток; мышечно-эласти-ческий слой, состоящий из гладкой мышечной ткани, между клетками которой в виде густой сети располагаются эластические волокна; наружный соединительнотканный слой, состоящий из рыхлой соединительной ткани. Эндотелий и подэндотелиальный слои аналогичны внутренней оболочке сосудов, мышечно-эластический является "эквивалентом" средней оболочки, а наружный соединительнотканный слой аналогичен наружной (адвентициальной) оболочке сосудов. Поверхность эндокарда идеально гладкая и не препятствует свободному движению крови. В предсердно-желудочковой области и у основания аорты эндокард образует дупликатуры (складки), именуемые клапанами. Различают предсердно-желудочковые и желудочково-сосудистые клапаны. В местах прикрепления клапанов имеются фиброзные кольца. Клапаны сердца — это плотные пластинки волокнистой соединительной ткани, покрытые эндотелием. Питание эндокарда происходит путем диффузии веществ из крови, находящейся в полостях предсердий и желудочков. Миокард (средняя оболочка сердца) — многотканевая оболочка, состоящая из поперчнополосатой сердечной мышечной ткани, межмышечной рыхлой соединительной ткани, многочисленных сосудов и капилляров, а также нервных элементов. Основной структурой является сердечная мышечная ткань, в свою очередь состоящая из клеток, формирующих и проводящих нервные импульсы, и клеток рабочего миокарда, обеспечивающих сокращение сердца (кардиомиоцитов). Среди клеток, формирующих и проводяших импульсы, в проводящей системе сердца различают три вида: Р-клетки (клетки-пейсмекеры), промежуточные клетки и клетки (волокна) Пуркиня.

Эпикард — наружная оболочка сердца — представляет собой висцеральный листок околосердечной сумки (перикарда). Свободная поверхность эпикарда выстлана мезотелием так же, как и поверхность перикарда, обращенная в перикардиальную полость. Под мезотелием в составе этих серозных оболочек находится соединительнотканная основа из рыхлой волокнистой соединительной ткани.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ СРЕЗОВ

Парафиновые срезы, окрашенные жирорастворимыми красителями. Для выявления некоторых липидов, которые не вымываются из тканей при обезвоживании, просветлении, заливке, депарафинировании и перенесении в воду, срезы следует заключать в среды, в которых жиры и красители не растворяются. Для этого достаточно удалять избыточную иоду и заключить срезы в гумми-сироп, глихрогель, глицерин — желатин и т. я.

Заключение в смолы.

После просветления в ксилоле окрашенных обычными методами срезов их заключают чаще всего в смолы. Раньше в качестве сред для заключения использовали растворы канадского бальзама или даммаровой смолы, сгущенного кедрового масла, эупараля и др. в ксилоле и хлороформе. В канадский бальзам срезы заключают после окрашивания гематоксилином или эозином.

Для заключения срезов, окрашенных анилиновым синим и кислотным фуксином, Кертис предложил подкислить бальзам салициловой кислотой. Часть раствора бальзама в ксилоле разбавляют до консистенции жидкого сиропа, насыщают кристаллами салициловой кислоты, фильтруют через фильтровальную бумагу и смешивают с равным объемом исходного раствора. Если раствор пересыщен, в препаратах часто выступают кристаллы салициловой кислоты.

Более удобны канадский бальзам, нейтральные эфирные смолы и некоторые цикло-парафиновые и терпеновые смолы; срезы можно заключать в слегка нагретые 60-80%-ные растворы этих веществ в ксилоле.

В результате неполного обезвоживания в окрашенных заключенных препаратах часто образуются непрозрачные или мутные зоны. Под микроскопом в таком участке среза и над ним обнаруживаются многочисленные мелкие капельки воды, окраска сильно выцветает. Чтобы избавиться от этого, снимают покровное стекло, смывают ксилолом синтетическую смолу или бальзам, обезвоживают срез в 100%-ном спирте, ацетоне или изопропиловом спирте, просветляют в смеси ксилола с обезвоживающим агентом и в 2-3 сменах свежего ксилола и вновь заключают.

Билет №2

Витальное (прижизненное) изучение клеток

Световой микроскоп позволяет видеть живые клетки. Для кратковременного наблюдения клетки помещают просто в жидкую среду на предметное стекло; если нужно длительное наблюдение за клетками, то используются специальные камеры. Это или плоские флаконы с отверстиями, закрытыми тонкими стеклами, или же разборные плоские камеры. В качестве объектов можно использовать свободноживущие клетки простейших и других одноклеточных организмов, клетки крови или же разобщенные тканевые клетки многоклеточных организмов как животного, так и растительного происхождения. В любом из этих случаев клетки изучают в специально подобранных средах. Свободноживущие одноклеточные организмы рассматривают и изучают в тех же средах, в которых они живут в естественных условиях или культивируются в лаборатории. Так, для некоторых простейших созданы искусственные среды, на которых они растут и размножаются. Обычно это сбалансированные солевые растворы с добавками микроорганизмов или других простейших, служащих пищей для данного вида организма

2) Кора представлена слоем серого вещества толщиной 3-5 мм. В коре насчитывают до 15 и более млрд. нейронов, а число глиоцитов в головном мозге — более 100 млрд. Развитие. Формирование коры больших полушарий происходит путем закономерной миграции нейробластов эпендимного слоя вдоль вертикально ориентированных радиальных глиоцитов. Первыми возникают наиболее поверхностный и глубокий слои коры. Затем возникают очередные последовательные волны миграции групп нейробластов, которые дифференцируются в нейроны V-гo, затем IV-гo слоя и д. т. Таким образом, нейробласты очередной волны миграции преодолевают слой нейронов, возникших от более ранней волны миграции. Это создает послойную (экранную) цитоархитектонику коры большого мозга. Между нейронами устанавливаются сложные взаимосвязи в соответствии с их местом в составе рефлекторных дуг. Формируются ядерные и экранные нервные центры. Тесные взаимоотношения в ходе гистогенеза складываются между нейронами и клетками глии. Строение. Все нейроны коры мулътиполярные. Среди них по форме клеток различают пирамидные и непирамидные (звездчатые, корзинчатые, веретенообразные, паукообразные и горизонтальные) нейроны. Пирамидные нейроны, наиболее характерны для коры, имеют тело, по форме напоминающее пирамиду, вершина которой обращена к поверхности коры. От основания пирамидной клетки отходит аксон, имеющий коллатерали (возвратные, горизонтальные, косые). От вершины и боковых поверхностей тела отходят длинные дендриты (апикальные и базальные). Апикальные дендриты группы нейронов объединяются в дендритические пучки. На поверхности дендритов одного пирамидного нейрона может быть до 4-6 тыс. специальных рецепторных аппаратов — шипиков. Наличие в последних актомиозинового комплекса позволяет изменять площадь синаптического контакта, следовательно, влиять на синаптическую связь.

3) Заливочные среды : Для получения тонких (до 6 мкм) гистологических срезов необходимо фиксированный и промытый материал залить в плотную среду, предварительно пропитав ею кусочки тканей. В зависимости от способа растворения все заливочные среды разделяются на растворимые в органических растворителях и водорастворимые. К первым относятся парафин, пластические полимеры на основе парафина, целлоидин, ко вторым – желатин, полиэтиленгликоли, полиэфиры, некоторые метакрилаты.

Парафин – смесь высокомолекулярных предельных углеводородов, продукт перегонки нефти; растворяется в анилине, бензоле, бергамотном масле, целлозольве, хлороформе, декалине, диоксане, бутаноле, пропаноле, толуоле, трихлориэтилене, ксилоле. Каждый из этих растворителей можно использовать в качестве промежуточной среды между спиртом и парафином. Температура плавления различных парафинов находится в диапазоне от 27 до 62?С. В гистологической технике применяют парафин с температурой плавления 56?С. Ряд зарубежных фирм производят специальный парафин для гистологических исследований, содержащий различные пластические полимеры, такие как диметилсульфоксид («Парапласт», «Гистопласт С», «Гистозес»). Отдельно следует выделить новую гомогенизированную парафиновую среду для заливки Histomix®, содержащую в своем составе натуральный воск и синтетические полимерные добавки. С точки зрения гистологической техники условия затвердевания парафина при заливке объекта весьма важны. Когда расплавленный парафин начинает затвердевать, на его поверхности возникает пленка в виде хлопьевидного облака, а затем начинают образовываться кристаллы, из которых состоит твердый парафин. Это изменение состояния парафина влечет за собой уменьшение его объема приблизительно на 5-10%, что обусловливает константные деформации заделанной в парафин ткани. Кристаллы парафина имеют форму пластинок или игл более или менее тонких, в зависимости от охлаждения. Чем охлаждение медленнее, тем тоньше кристаллы. Следует отметить, что кристаллы, выпадающие в тканевых пространствах при заключении объекта в парафин, не оказывают деформирующего влияния по причине своих небольших размеров. Когда парафин начинает затвердевать – он непрозрачен, затем становится прозрачным, с блестящей поверхностью. В этот момент сжатие парафина прекращается.

Ватутина