Непрямой иммуноферментный анализ – этапы проведения

В непрямом иммуноферментном анализе два этапа. При проведении первого этапа используют немеченые антитела к выявляемым антигенам, а во втором этапе применяют меченые антитела к первым немеченым антителам. То есть получается не прямое связывание антитела с антигеном, а двойной контроль: связывание антител с антигеном, после чего связывание вторых антител с комплексом антитело + антиген. Как правило, антитела для первого этапа – мышиные, а для второго – козьи.

Фиксация антигенов на поверхности лунки и связывание антигена с немеченым антителом
Так же как и для прямого иммуноферментного анализа производится забор биологического материала – кровь, соскобы, мазки. Исследуемый биологический материал вносят в лунки и оставляют на 15-30 минут для приклеивания антигенов к поверхности лунок. Затем в лунки вносят немеченые антитела к антигенам и оставляют на промежуток времени (1-5 часов), чтобы антитела связались со «своими» антигенами и образовали иммунный комплекс (первый этап). После чего удаляют «лишние», не связавшиеся антитела, путем выливания содержимого лунок. Производят промывку специальным раствором для полного удаления всех не связавшихся антител.

Связывание меченого антитела с комплексом антиген + немеченое антитело
После чего берут вторые антитела – меченые, добавляют в лунки и опять оставляют на некоторое время – 15-30 минут (второй этап). За это время меченые антитела связываются с первыми – не мечеными и образуют комплекс – антитело + антитело + антиген. Однако и меченые, и не меченые антитела вносятся в лунки в избытке. Поэтому нужно опять удалить «лишние», уже меченые антитела, которые не связались с немечеными антителами. Для этого повторяют процедуру выливания содержимого лунок и промывки специальным раствором.

Ферментативная реакция – образование окрашенного соединения
После чего вносят фермент, осуществляющий реакцию превращения «метки» в окрашенное вещество. Окраска развивается в течение 5-30 минут. Затем проводят колориметрию и вычисляют концентрацию окрашенного вещества. Поскольку концентрация окрашенного вещества равна концентрации меченых антител, а концентрация меченых равна концентрации немеченых антител, которая, в свою очередь равна концентрации антигена. Таким образом, получаем концентрацию выявляемого антигена.
Такой двойной контроль в виде использования двух видов антител позволил повысить чувствительность и специфичность метода иммуноферментного анализа. Несмотря на удлинение времени проведения анализа и включение дополнительных этапов, эти потери компенсируются точностью результата. Именно поэтому в настоящее время подавляющее большинство методик иммуноферментного анализа – это непрямой иммуноферментный анализ.

Какие заболевания выявляют методом иммуноферментной диагностики?

Перейдем к рассмотрению того, какие заболевания и какие биологически активные вещества выявляются методом иммуноферментного анализа. Вещества, выявляемые методом иммуноферментного анализа, представлены в таблице.

В таблице приведен далеко не полный перечень анализов (только наиболее распространенные), выполняемых с помощью иммуноферментного анализа. Привести же весь список не представляется возможным, поскольку он будет очень большим и постоянно пополняющимся. Помимо лабораторной диагностики метод иммуноферментного анализа широко используется в научных исследованиях.

http://oncohematology.abvpress.ru/index.php/ongm/article/viewFile/28/43

Тромбоциты являются носителями антигенов раз- личных аллогенных систем. Наиболее значимыми яв- ляются антигены собственно тромбоцит спцифичные(HPA (Human Platelet Antigens) – их 21), главного комплекса гистосовместимости HLA I, а также эритроцитов. На мембране тромбоцитов присутствуют антигены системы АВ0, Левис, I, i, P, но отсутствуют антигены систем Резус, Даффи, Келл, Кидд и Лютеран [1–6]. Антигены главного комплекса гистосовместимо- сти – HLA (Human Leukocyte Antigens) – экспресси- рованы уже на мегакариоцитах и крепко связаны с мембраной тромбоцитов [7]. Существует другая точ- ка зрения, согласно которой присутствие антигенов HLA является результатом их сорбции из плазмы. При этом количество HLA-антигенов, присутствующих в плазме, не коррелирует с количеством таковых на тромбоцитах, так как адсорбируется лишь их малая часть [8]. Тромбоциты несут на своей поверхности только антигены HLA класса I. Среди них преобладают HLA А и HLA В. HLA С на тромбоцитах присутствуют в небольшом количестве. Вариации HLA-экспрессии могут иметь клиническое значение при трансфузиях донорских тромбоцитов с низким содержанием анти- генных детерминант способных нормально выживать у больного с HLA-антителами [2, 9]. Количество ан- тигенных детерминант зависит от генотипа: в гомози-готном состоянии на одном тромбоците содержится от 34 000 до 43 000 молекул НРА-la, в гетерозиготном – от 19 000 до 24 000 молекул. Если сравнить количество HLA-детерминант (например, HLA-А2 присутствует в количестве от 4000 до 10 000 детерминант на тром- боцит), расположенных на том же гликопротеине, можно заметить, что их экспрессировано значительно меньше, чем НРА-детерминант. Эти данные позволя- ют предположить, что в некоторых случаях антитела к тромбоцитам могут играть более существенную роль в разрушении тромбоцитов, чем анти-HLA-антитела.

Антигены системы HPA локализованы на глико- протеиновых (GP) комплексах как представлено на ри- сунке [3, 4]. GP-мембраны относятся к семейству ин- тегринов – рецепторов, имеющих сходную структуру и ответственных за взаимодействие между клетками, а также между клетками и белками.

GP-комплексы являются ключевыми для гемоста- за и отвечают за пошаговый процесс прикрепления тромбоцита к поврежденной сосудистой стенке. Ком- плекс GPIb/IX/V – главный рецептор для фактора Виллебранда, обеспечивающий прикрепление тром- боцитов к поврежденному субэндотелию. Комплекс GPIa/IIa, являясь коллагеновым рецептором, подде- рживает связь тромбоцита с коллагеном, тогда как рецептор GPVI проводит сигнал через мембрану внутрь клетки для последующей активации тромбоци- та, в результате этого тромбоциты связываются между собой с помощью фибриногена посредством активи- рованных рецепторов GP IIb/IIIa. Функция CD109 изучена недостаточно [10].

Применение молекулярно-генетических методов позволило изучить частоту аллелей среди различных расовых и этнических групп населения. В популяции белых европейцев частота аллелей большинства НРА- систем отклоняется в сторону «а» аллеля, а гомозиготы по «b» составляют около 0–15 %. Исследования час- тоты встречаемости аллоантигенов тромбоцитов в раз- ных зарубежных популяциях указывают на значитель- ные различия в распространенности этих антигенов среди жителей разных стран. Например, HPA-1 поли- морфизм почти отсутствует в популяциях Дальнего Востока, в то время как HPA-4 полиморфизм практи- чески отсутствует у белых европейцев, но присутству- ет в дальневосточной популяции. Данные о частоте встречаемости HPA в российской популяции огра- ничены единичными исследованиями. Нами было генотипировано 402 донора г. Санкт-Петербурга. По- лученные данные представлены в табл. 2 в сравнении с данными европейской популяции [11]. По нашим данным, у доноров крови г. Санкт-Пе- тербурга гены локусов HPA-1, 2, 3, 5 являются поли- морфными, а гены локуса HPA-4 не полиморфны.

Антитела, вырабаты- ваемые к тромбоцитам, разделяют на аутоантитела, аллоантитела и лекарственно-зависимые антитела.

Бóльшая часть аутоантител принадлежит к классу IgG, меньшая часть – к IgМ и IgА. Выработка аутоантител к тромбоцитам может приводить к развитию аутоиммунной тромбоцитопенической пурпуры, тромбоцитопении новорожденных (опосредованной наличием аутоиммунных антител у матери) и рефрактерности к трансфузиям донорских тромбоцитов (при наличии аутоантител у реципиента).

Сенсибилизация аллоантигенами в результате беременностей или гемотрансфузий может приводить к выработке аллоантител. По специфичности аллоантитела к тромбоцитам подразделяют на 3 группы: АВ0-антитела, HLA-антитела и антитела к тромбоцит- специфичным антигенам.

Появление у реципиента анти-НРА и анти-HLA- антител может являться причиной развития иммуноло- гических реакций негемолитического типа и привести к полному отсутствию клинического эффекта от пере- ливания тромбоцитов. Иногда после трансфузий тром- боцитов доноров, несовместимых с реципиентом как по НРА, так и HLA, в организме больного происходят тяжелые нарушения в иммунной системе, проявляю- щиеся развитием аутоиммунной тромбоцитопении и приводящие к тяжелым геморрагическим проявлени- ям

Установлено, что HLA-иммунизация развивается только в ответ на введение несовместимых лейкоци- тов. Трансфузии тромбоцитов сами по себе не могут вызвать выработку HLA-антител, так как они не со- держат антигенов II класса гистосовместимости, не- обходимых для Т-хелперной активации В-клеток (только В-лимфоциты, активированные Т-клетками и моноцитами крови, могут давать необходимый сти- мул для продукции антител) [12]. Аллоиммунизация к антигенам тромбоцитов возникает чаще у реципи- ентов, имеющих в анамнезе многократные трансфузии цельной крови и компонентов, так как с каждой пос- ледующей трансфузией повышается вероятность по- лучения антигена, отсутствующего у реципиента, и возникновения иммунного ответа.

Клиническими последствиями аллоиммунизации могут быть: рефрактерность к трансфузиям тромбоци- тов, посттрансфузионная тромбоцитопеническая пур- пура (ПТП) и аллоиммунная тромбоцитопения плода и новорожденного (АИТПН)

Посттрансфузионная тромбоцитопеническая пурпура Клинический случай тромбоцитопении, развив- шейся у женщины на 7-е сутки после трансфузии тромбоцитов и спонтанно разрешившейся через 3 нед, был впервые описан в 1959 г. van Loglem et al. Спустя 2 года подобный случай описали Shulman et al. и ввели термин «посттрансфузионная тромбоцитопеническая пурпура». ПТП развивается у сенсибилизированого реципиента с анти-НРА-антителами, которому пере- ливают тромбоциты донора с антигенами, к которым имеются антитела. Данное осложнение развивается у гомозиготных по НРА реципиентов и может ассоци- ироваться с тромбоцитарными антителами одной или нескольких специфичностей [14]. ПТП чаще встреча- ется у женщин, имеющих в анамнезе беременности, развивается на 7–10-е сутки после трансфузии тром- боцитов и сопровождается тромбоцитопенией. Забо- левание начинается быстро и характеризуется паде- нием количества тромбоцитов менее 10 × 109 .Средняя и тяжелая степень течения сопровождается кровоте- чением из слизистых оболочек пищеварительного и мочевого тракта. Развитие данного осложнения связано с наличием определенной аллели HLA II клас- са-DRB3*01:01 [4]. Специфичность антител, вызыва- ющих данное осложнение, установлена только в не- скольких исследованиях зарубежных авторов. Чаще всего причиной ПТП являются антитела анти-HPA-1а (85 % случаев), 2b (5 %), 3а (7 %) [5].

Аллоиммунная тромбоцитопения плода и новорожденного АИТПН развивается в результате разрушения тромбоцитов ребенка антителами матери, направлен- ными против специфических HPA. Частота встречае- мости данной патологии составляет 1 случай на 1200 ро- дов в европейской популяции и 1 на 500–700 родов в Японии [4, 5]. Патогенез данного заболевания ана- логичен патогенезу гемолитической болезни новорож- денных, обусловленной несовместимостью матери и плода по антигену D системы Резус. В отличие от несовместимости по D-антигену, АИТПН может раз- виться уже при первой беременности [20–24]. Выра- ботка антител у матери при беременности происходит к антигенам тромбоцитов плода, унаследованным от отца и отсутствующим у матери. Антитела матери, принадлежащие к IgG, проникая через плацентарный барьер и адсорбируясь на антигенах тромбоцитов пло- да, вызывают их деструкцию макрофагами [20]. Боль- шинство антигенов тромбоцитов плода экспресси- руются уже к 18-й неделе беременности, поэтому деструкция тромбоцитов может наблюдаться на ран- них сроках. После рождения тяжесть проявления тромбоцитопении зависит от скорости удаления анти- тромбоцитарных антител матери из кровотока плода.

Обычно количество тромбоцитов плода возвращается к норме в течение 1–3 нед после родов. Заболевание часто является кратковременным, протекающим без последствий для здоровья ребенка. Но встречаются и тяжелые формы с развитием внутричерепных кро- воизлияний и, как следствие, нейрологических нару- шений или смерти в период тромбоцитопении. Согласно данным литературы, половина случаев внутричереп- ных кровоизлияний, ассоциированных с аллоиммун- ной тромбоцитопенией, происходит внутриутробно [20–24]. В европейской популяции 2–2,5 % беремен- ных женщин не имеют антигена HPA-1a, и большин- ство из них ожидают детей HPA-1a положительных, так как 97,5 % людей имеют этот антиген. Однако только 6–12 % этих женщин вырабатывают HPA-1a- антитела. Выработка антител связана со специфично- стью антигена HLA-DR. Так, наличие у матери аллели HLA-DRB3*01:01 стимулирует выработку анти- HPA-1a-антител, а наличие HLA-DRB1*13 и HLADRB1*14 – анти-HPA-5b-антител [22, 25]. Среди бело- го населения 80–90 % случаев АИТПН обусловлены анти-HPA-1a-антителами, 10–15 % – анти-HPA-5b- антителами и малая часть – анти-HPA-3а-антителами. В литературе также описаны случаи тромбоцитопе- нии, вызванной антителами другой специфичности [5, 26–30].

Все перечисленное привело к применению за ру- бежом, кроме HLA-перекрестной пробы, перекрестной пробы с тромбоцитами донора, а также к типирова- нию антигенов тромбоцитов при подборе совмести- мых гемокомпонентов аллоиммунизированным реци- пиентам [9]. Учитывая определенные трудности типирования тромбоцитарных антигенов серологическими метода- ми, в последние годы все чаще с этой целью применя- ются молекулярно-генетические методы, основанные на использовании полимеразной цепной реакции (ПЦР). С учетом имеющихся в настоящее время дан- ных о характере и месторасположении единичных нуклеотидных замен, обусловливающих полиморфизм НРА, молекулярно-генетические методы типирования антигенов тромбоцитов сводятся к детекции этих за- мен в структуре ДНК соответствующих генов.

Молекулярно-генетические методы детекции антигенов тромбоцитов Для детекции НРА к настоящему времени предло- жено несколько методов, основанных на технологии ПЦР: полиморфизма длин рестрикционных фрагмен- тов (ПЦР-ПДРФ), ПЦР с аллель-специфическими праймерами (ПЦР-АСП) и ПЦР-гибридизация с ал- лель-специфичными олигонуклеотидами (АСО).

Выявление антител к тромбоцитам Проведенный нами анализ данных литературы о существующих методах выявления антитромбоцитарных антител, показал, что наиболее эффективными являются методы иммуноферментного анализа и иммунофлюоресцентные Однако проведение тестов с использованием указанных методов требует наличия дорогостоящего оборудования или/и реактивов, что ограничивает их применение. В связи с этим, за рубежом был разработан твердофазный антиглобулиновый тест, принцип которого заключается в адсорбции донорских тромбоцитов, предварительно сенсибилизированных исследуемой сывороткой реципиента, на поверхность плашки и последующей детекции антител после добавления эритроцитов, нагруженных анти-IgG-антителами. При наличии в исследуемой сыворотке антитромбоцитарных антител, анти-IgG взаимодействует с ними, что приводит к равномерному распределению эритроцитов по плашке. При отсутствии антитромбоцитарных антител эритроциты образуют осадок в виде точки. Многими авторами была показана высокая чувствительность твердофазного метода для определения ауто- и аллоантител.

«Золотым стандартом» для идентификации тром- боцит-специфических антител признан метод им- мобилизации тромбоцитарных антигенов специфи- ческими моноклональными антителами (MAIPA) с использованием моноклональных мышиных анти- тел, специфичных к гликопротеинам тромбоцитов. Преимущество MAIPA состоит в том, что антитела (человека и мышиные) присоединяются к соответс- твующему антигену мембраны тромбоцита, что позво- ляет сократить ложноположительные реакции. Метод позволяет не только выявлять антитела, но и прово- дить фенотипирование редко встречающихся антиге- нов (например, HPA-5b/5b). Однако метод имеет и свои недостатки. Выявление антител основано на формировании трехмолекулярного соединения, связывающего мышиные и человеческие антитела с мембраной тромбоцита, на которой локализованы соответствующие эпитопы. Ложноотрицательные ре- зультаты могут наблюдаться вследствие конкуренции между человеческими и мышиными антителами за присоединение к одному и тому же эпитопу, что за- трудняет диагностику иммунных тромбоцитопений. Кроме того, метод очень трудоемкий и не подходит для скрининга.

Другим методом, обладающим высокой чувстви- тельностью и специфичностью, является метод про- точной цитофлуориметрии. Метод позволяет выяв- лять антитромбоцитарные антитела разных классов иммуноглобулинов (IgM, IgG и IgА) [34]. По данным литературы, проточная цитометрия является первым шагом для выявления антител. Преимуществами слу- жат высокая скорость, позволяющая анализировать большие клеточные объемы, и возможность выпол- нения сложных одновременных измерений несколь- ких параметров каждой клетки в одной суспензии. Все это позволяет использовать метод для скринин- говых исследований [50–51]. На втором этапе при- меняется метод MAIPA, позволяющий определять специфичность антител. Такой алгоритм дает воз- можность проводить исследования антител более эф- фективно