Мегаобучалка Главная | О нас | Обратная связь  


Непрямой иммуноферментный анализ – этапы проведения




Поможем в ✍️ написании учебной работы
Поможем с курсовой, контрольной, дипломной, рефератом, отчетом по практике, научно-исследовательской и любой другой работой

В непрямом иммуноферментном анализе два этапа. При проведении первого этапа используют немеченые антитела к выявляемым антигенам, а во втором этапе применяют меченые антитела к первым немеченым антителам. То есть получается не прямое связывание антитела с антигеном, а двойной контроль: связывание антител с антигеном, после чего связывание вторых антител с комплексом антитело + антиген. Как правило, антитела для первого этапа – мышиные, а для второго – козьи.

Фиксация антигенов на поверхности лунки и связывание антигена с немеченым антителом
Так же как и для прямого иммуноферментного анализа производится забор биологического материала – кровь, соскобы, мазки. Исследуемый биологический материал вносят в лунки и оставляют на 15-30 минут для приклеивания антигенов к поверхности лунок. Затем в лунки вносят немеченые антитела к антигенам и оставляют на промежуток времени (1-5 часов), чтобы антитела связались со «своими» антигенами и образовали иммунный комплекс (первый этап). После чего удаляют «лишние», не связавшиеся антитела, путем выливания содержимого лунок. Производят промывку специальным раствором для полного удаления всех не связавшихся антител.



Связывание меченого антитела с комплексом антиген + немеченое антитело
После чего берут вторые антитела – меченые, добавляют в лунки и опять оставляют на некоторое время – 15-30 минут (второй этап). За это время меченые антитела связываются с первыми – не мечеными и образуют комплекс – антитело + антитело + антиген. Однако и меченые, и не меченые антитела вносятся в лунки в избытке. Поэтому нужно опять удалить «лишние», уже меченые антитела, которые не связались с немечеными антителами. Для этого повторяют процедуру выливания содержимого лунок и промывки специальным раствором.

Ферментативная реакция – образование окрашенного соединения
После чего вносят фермент, осуществляющий реакцию превращения «метки» в окрашенное вещество. Окраска развивается в течение 5-30 минут. Затем проводят колориметрию и вычисляют концентрацию окрашенного вещества. Поскольку концентрация окрашенного вещества равна концентрации меченых антител, а концентрация меченых равна концентрации немеченых антител, которая, в свою очередь равна концентрации антигена. Таким образом, получаем концентрацию выявляемого антигена.
Такой двойной контроль в виде использования двух видов антител позволил повысить чувствительность и специфичность метода иммуноферментного анализа. Несмотря на удлинение времени проведения анализа и включение дополнительных этапов, эти потери компенсируются точностью результата. Именно поэтому в настоящее время подавляющее большинство методик иммуноферментного анализа – это непрямой иммуноферментный анализ.


Какие заболевания выявляют методом иммуноферментной диагностики?

Перейдем к рассмотрению того, какие заболевания и какие биологически активные вещества выявляются методом иммуноферментного анализа. Вещества, выявляемые методом иммуноферментного анализа, представлены в таблице.

Гормоны и маркеры заболеваний щитовидной железы Тиреопероксидаза (ТПО)
Тиреоглобулин (ТГ)
Тиреотропный гормон (ТТГ)
Тироксин (Т4)
Трийодтиронин (Т3)
Свободный тироксин (Т4)
Свободный трийодтиронин (Т3)
Диагностика репродуктивной функции Лютеинизирующий гормон (ЛГ)
Фолликулостимулирующий гормон (ФСГ)
Хорионический гонадотропин (ХГ)
Пролактин
Прогестерон
Эстрадиол
Тестостерон
Кортизол
Стероид связывающий глобулин (ССГ)
Альфафетопротеин (АФП)
Онкомаркеры Хорионический гонадотропин (ХГ)
Простатспецифический антиген (ПСА)
СА – 125
СА – 19.9
CYFRA – 21-1
М – 12 (СА – 15.3)
MUC – 1 (M – 22)
MUC1 (M – 20)
Альвеомуцин
К – цепь
L – цепь
Фактор некроза опухолей (ФНОα)
γ – интерферон
Раково-эмбриональный антиген (РЭА)
Диагностика инфекционных заболеваний Токсоплазма (IgG, IgM)
Краснуха (IgG, IgM)
Цитомегаловирус (IgG, IgM)
Герпес (IgG, IgM)
Туберкулез (IgG, IgM)
Корь (IgG, IgM)
Гепатит Д, Е, А (ВГД, ВГЕ, ВГА)
Гепатит С (ат ВГС, ВГСсore)
Гепатит В (НВs, НВе НВсore)
Уреаплазма (IgG, IgM)
Микоплазма (IgG, IgM)
Хламидия (IgG, IgM)
Микоплазма (IgG)
Сифилис (IgG)
Аспергиллёз (IgG)
Лямблии (IgG)
Helicobacter Pylori (IgG)
Псевдотуберкулез (IgG, IgM)
Кандида (IgG)
Герпес (IgG, IgM)
Эпштейн-Барр (IgG, IgM)
Цитомегаловирус (IgG, IgM)
Диагностика аутоиммунных заболеваний и определение иммунного статуса IgE – общий
С-реактивный белок (СРБ)
Глиадин (IgG, IgA)
IgG4
Общий IgG
IgG2
Общий IgA
Секреторный IgA
Общий IgD
Общий IgМ
Циркулирующие иммунные комплексы (ЦИК)
Маркеры заболеваний сердца Тропонин I


В таблице приведен далеко не полный перечень анализов (только наиболее распространенные), выполняемых с помощью иммуноферментного анализа. Привести же весь список не представляется возможным, поскольку он будет очень большим и постоянно пополняющимся. Помимо лабораторной диагностики метод иммуноферментного анализа широко используется в научных исследованиях.

 

http://oncohematology.abvpress.ru/index.php/ongm/article/viewFile/28/43

Тромбоциты являются носителями антигенов раз- личных аллогенных систем. Наиболее значимыми яв- ляются антигены собственно тромбоцит спцифичные(HPA (Human Platelet Antigens) – их 21), главного комплекса гистосовместимости HLA I, а также эритроцитов. На мембране тромбоцитов присутствуют антигены системы АВ0, Левис, I, i, P, но отсутствуют антигены систем Резус, Даффи, Келл, Кидд и Лютеран [1–6]. Антигены главного комплекса гистосовместимо- сти – HLA (Human Leukocyte Antigens) – экспресси- рованы уже на мегакариоцитах и крепко связаны с мембраной тромбоцитов [7]. Существует другая точ- ка зрения, согласно которой присутствие антигенов HLA является результатом их сорбции из плазмы. При этом количество HLA-антигенов, присутствующих в плазме, не коррелирует с количеством таковых на тромбоцитах, так как адсорбируется лишь их малая часть [8]. Тромбоциты несут на своей поверхности только антигены HLA класса I. Среди них преобладают HLA А и HLA В. HLA С на тромбоцитах присутствуют в небольшом количестве. Вариации HLA-экспрессии могут иметь клиническое значение при трансфузиях донорских тромбоцитов с низким содержанием анти- генных детерминант способных нормально выживать у больного с HLA-антителами [2, 9]. Количество ан- тигенных детерминант зависит от генотипа: в гомози-готном состоянии на одном тромбоците содержится от 34 000 до 43 000 молекул НРА-la, в гетерозиготном – от 19 000 до 24 000 молекул. Если сравнить количество HLA-детерминант (например, HLA-А2 присутствует в количестве от 4000 до 10 000 детерминант на тром- боцит), расположенных на том же гликопротеине, можно заметить, что их экспрессировано значительно меньше, чем НРА-детерминант. Эти данные позволя- ют предположить, что в некоторых случаях антитела к тромбоцитам могут играть более существенную роль в разрушении тромбоцитов, чем анти-HLA-антитела.

Антигены системы HPA локализованы на глико- протеиновых (GP) комплексах как представлено на ри- сунке [3, 4]. GP-мембраны относятся к семейству ин- тегринов – рецепторов, имеющих сходную структуру и ответственных за взаимодействие между клетками, а также между клетками и белками.

GP-комплексы являются ключевыми для гемоста- за и отвечают за пошаговый процесс прикрепления тромбоцита к поврежденной сосудистой стенке. Ком- плекс GPIb/IX/V – главный рецептор для фактора Виллебранда, обеспечивающий прикрепление тром- боцитов к поврежденному субэндотелию. Комплекс GPIa/IIa, являясь коллагеновым рецептором, подде- рживает связь тромбоцита с коллагеном, тогда как рецептор GPVI проводит сигнал через мембрану внутрь клетки для последующей активации тромбоци- та, в результате этого тромбоциты связываются между собой с помощью фибриногена посредством активи- рованных рецепторов GP IIb/IIIa. Функция CD109 изучена недостаточно [10].

Применение молекулярно-генетических методов позволило изучить частоту аллелей среди различных расовых и этнических групп населения. В популяции белых европейцев частота аллелей большинства НРА- систем отклоняется в сторону «а» аллеля, а гомозиготы по «b» составляют около 0–15 %. Исследования час- тоты встречаемости аллоантигенов тромбоцитов в раз- ных зарубежных популяциях указывают на значитель- ные различия в распространенности этих антигенов среди жителей разных стран. Например, HPA-1 поли- морфизм почти отсутствует в популяциях Дальнего Востока, в то время как HPA-4 полиморфизм практи- чески отсутствует у белых европейцев, но присутству- ет в дальневосточной популяции. Данные о частоте встречаемости HPA в российской популяции огра- ничены единичными исследованиями. Нами было генотипировано 402 донора г. Санкт-Петербурга. По- лученные данные представлены в табл. 2 в сравнении с данными европейской популяции [11]. По нашим данным, у доноров крови г. Санкт-Пе- тербурга гены локусов HPA-1, 2, 3, 5 являются поли- морфными, а гены локуса HPA-4 не полиморфны.

Антитела, вырабаты- ваемые к тромбоцитам, разделяют на аутоантитела, аллоантитела и лекарственно-зависимые антитела.

Бóльшая часть аутоантител принадлежит к классу IgG, меньшая часть – к IgМ и IgА. Выработка аутоантител к тромбоцитам может приводить к развитию аутоиммунной тромбоцитопенической пурпуры, тромбоцитопении новорожденных (опосредованной наличием аутоиммунных антител у матери) и рефрактерности к трансфузиям донорских тромбоцитов (при наличии аутоантител у реципиента).

Сенсибилизация аллоантигенами в результате беременностей или гемотрансфузий может приводить к выработке аллоантител. По специфичности аллоантитела к тромбоцитам подразделяют на 3 группы: АВ0-антитела, HLA-антитела и антитела к тромбоцит- специфичным антигенам.

Появление у реципиента анти-НРА и анти-HLA- антител может являться причиной развития иммуноло- гических реакций негемолитического типа и привести к полному отсутствию клинического эффекта от пере- ливания тромбоцитов. Иногда после трансфузий тром- боцитов доноров, несовместимых с реципиентом как по НРА, так и HLA, в организме больного происходят тяжелые нарушения в иммунной системе, проявляю- щиеся развитием аутоиммунной тромбоцитопении и приводящие к тяжелым геморрагическим проявлени- ям

Установлено, что HLA-иммунизация развивается только в ответ на введение несовместимых лейкоци- тов. Трансфузии тромбоцитов сами по себе не могут вызвать выработку HLA-антител, так как они не со- держат антигенов II класса гистосовместимости, не- обходимых для Т-хелперной активации В-клеток (только В-лимфоциты, активированные Т-клетками и моноцитами крови, могут давать необходимый сти- мул для продукции антител) [12]. Аллоиммунизация к антигенам тромбоцитов возникает чаще у реципи- ентов, имеющих в анамнезе многократные трансфузии цельной крови и компонентов, так как с каждой пос- ледующей трансфузией повышается вероятность по- лучения антигена, отсутствующего у реципиента, и возникновения иммунного ответа.

Клиническими последствиями аллоиммунизации могут быть: рефрактерность к трансфузиям тромбоци- тов, посттрансфузионная тромбоцитопеническая пур- пура (ПТП) и аллоиммунная тромбоцитопения плода и новорожденного (АИТПН)

Посттрансфузионная тромбоцитопеническая пурпура Клинический случай тромбоцитопении, развив- шейся у женщины на 7-е сутки после трансфузии тромбоцитов и спонтанно разрешившейся через 3 нед, был впервые описан в 1959 г. van Loglem et al. Спустя 2 года подобный случай описали Shulman et al. и ввели термин «посттрансфузионная тромбоцитопеническая пурпура». ПТП развивается у сенсибилизированого реципиента с анти-НРА-антителами, которому пере- ливают тромбоциты донора с антигенами, к которым имеются антитела. Данное осложнение развивается у гомозиготных по НРА реципиентов и может ассоци- ироваться с тромбоцитарными антителами одной или нескольких специфичностей [14]. ПТП чаще встреча- ется у женщин, имеющих в анамнезе беременности, развивается на 7–10-е сутки после трансфузии тром- боцитов и сопровождается тромбоцитопенией. Забо- левание начинается быстро и характеризуется паде- нием количества тромбоцитов менее 10 × 109 .Средняя и тяжелая степень течения сопровождается кровоте- чением из слизистых оболочек пищеварительного и мочевого тракта. Развитие данного осложнения связано с наличием определенной аллели HLA II клас- са-DRB3*01:01 [4]. Специфичность антител, вызыва- ющих данное осложнение, установлена только в не- скольких исследованиях зарубежных авторов. Чаще всего причиной ПТП являются антитела анти-HPA-1а (85 % случаев), 2b (5 %), 3а (7 %) [5].

Аллоиммунная тромбоцитопения плода и новорожденного АИТПН развивается в результате разрушения тромбоцитов ребенка антителами матери, направлен- ными против специфических HPA. Частота встречае- мости данной патологии составляет 1 случай на 1200 ро- дов в европейской популяции и 1 на 500–700 родов в Японии [4, 5]. Патогенез данного заболевания ана- логичен патогенезу гемолитической болезни новорож- денных, обусловленной несовместимостью матери и плода по антигену D системы Резус. В отличие от несовместимости по D-антигену, АИТПН может раз- виться уже при первой беременности [20–24]. Выра- ботка антител у матери при беременности происходит к антигенам тромбоцитов плода, унаследованным от отца и отсутствующим у матери. Антитела матери, принадлежащие к IgG, проникая через плацентарный барьер и адсорбируясь на антигенах тромбоцитов пло- да, вызывают их деструкцию макрофагами [20]. Боль- шинство антигенов тромбоцитов плода экспресси- руются уже к 18-й неделе беременности, поэтому деструкция тромбоцитов может наблюдаться на ран- них сроках. После рождения тяжесть проявления тромбоцитопении зависит от скорости удаления анти- тромбоцитарных антител матери из кровотока плода.

Обычно количество тромбоцитов плода возвращается к норме в течение 1–3 нед после родов. Заболевание часто является кратковременным, протекающим без последствий для здоровья ребенка. Но встречаются и тяжелые формы с развитием внутричерепных кро- воизлияний и, как следствие, нейрологических нару- шений или смерти в период тромбоцитопении. Согласно данным литературы, половина случаев внутричереп- ных кровоизлияний, ассоциированных с аллоиммун- ной тромбоцитопенией, происходит внутриутробно [20–24]. В европейской популяции 2–2,5 % беремен- ных женщин не имеют антигена HPA-1a, и большин- ство из них ожидают детей HPA-1a положительных, так как 97,5 % людей имеют этот антиген. Однако только 6–12 % этих женщин вырабатывают HPA-1a- антитела. Выработка антител связана со специфично- стью антигена HLA-DR. Так, наличие у матери аллели HLA-DRB3*01:01 стимулирует выработку анти- HPA-1a-антител, а наличие HLA-DRB1*13 и HLADRB1*14 – анти-HPA-5b-антител [22, 25]. Среди бело- го населения 80–90 % случаев АИТПН обусловлены анти-HPA-1a-антителами, 10–15 % – анти-HPA-5b- антителами и малая часть – анти-HPA-3а-антителами. В литературе также описаны случаи тромбоцитопе- нии, вызванной антителами другой специфичности [5, 26–30].

Все перечисленное привело к применению за ру- бежом, кроме HLA-перекрестной пробы, перекрестной пробы с тромбоцитами донора, а также к типирова- нию антигенов тромбоцитов при подборе совмести- мых гемокомпонентов аллоиммунизированным реци- пиентам [9]. Учитывая определенные трудности типирования тромбоцитарных антигенов серологическими метода- ми, в последние годы все чаще с этой целью применя- ются молекулярно-генетические методы, основанные на использовании полимеразной цепной реакции (ПЦР). С учетом имеющихся в настоящее время дан- ных о характере и месторасположении единичных нуклеотидных замен, обусловливающих полиморфизм НРА, молекулярно-генетические методы типирования антигенов тромбоцитов сводятся к детекции этих за- мен в структуре ДНК соответствующих генов.

Молекулярно-генетические методы детекции антигенов тромбоцитов Для детекции НРА к настоящему времени предло- жено несколько методов, основанных на технологии ПЦР: полиморфизма длин рестрикционных фрагмен- тов (ПЦР-ПДРФ), ПЦР с аллель-специфическими праймерами (ПЦР-АСП) и ПЦР-гибридизация с ал- лель-специфичными олигонуклеотидами (АСО).

Выявление антител к тромбоцитам Проведенный нами анализ данных литературы о существующих методах выявления антитромбоцитарных антител, показал, что наиболее эффективными являются методы иммуноферментного анализа и иммунофлюоресцентные Однако проведение тестов с использованием указанных методов требует наличия дорогостоящего оборудования или/и реактивов, что ограничивает их применение. В связи с этим, за рубежом был разработан твердофазный антиглобулиновый тест, принцип которого заключается в адсорбции донорских тромбоцитов, предварительно сенсибилизированных исследуемой сывороткой реципиента, на поверхность плашки и последующей детекции антител после добавления эритроцитов, нагруженных анти-IgG-антителами. При наличии в исследуемой сыворотке антитромбоцитарных антител, анти-IgG взаимодействует с ними, что приводит к равномерному распределению эритроцитов по плашке. При отсутствии антитромбоцитарных антител эритроциты образуют осадок в виде точки. Многими авторами была показана высокая чувствительность твердофазного метода для определения ауто- и аллоантител.

«Золотым стандартом» для идентификации тром- боцит-специфических антител признан метод им- мобилизации тромбоцитарных антигенов специфи- ческими моноклональными антителами (MAIPA) с использованием моноклональных мышиных анти- тел, специфичных к гликопротеинам тромбоцитов. Преимущество MAIPA состоит в том, что антитела (человека и мышиные) присоединяются к соответс- твующему антигену мембраны тромбоцита, что позво- ляет сократить ложноположительные реакции. Метод позволяет не только выявлять антитела, но и прово- дить фенотипирование редко встречающихся антиге- нов (например, HPA-5b/5b). Однако метод имеет и свои недостатки. Выявление антител основано на формировании трехмолекулярного соединения, связывающего мышиные и человеческие антитела с мембраной тромбоцита, на которой локализованы соответствующие эпитопы. Ложноотрицательные ре- зультаты могут наблюдаться вследствие конкуренции между человеческими и мышиными антителами за присоединение к одному и тому же эпитопу, что за- трудняет диагностику иммунных тромбоцитопений. Кроме того, метод очень трудоемкий и не подходит для скрининга.

Другим методом, обладающим высокой чувстви- тельностью и специфичностью, является метод про- точной цитофлуориметрии. Метод позволяет выяв- лять антитромбоцитарные антитела разных классов иммуноглобулинов (IgM, IgG и IgА) [34]. По данным литературы, проточная цитометрия является первым шагом для выявления антител. Преимуществами слу- жат высокая скорость, позволяющая анализировать большие клеточные объемы, и возможность выпол- нения сложных одновременных измерений несколь- ких параметров каждой клетки в одной суспензии. Все это позволяет использовать метод для скринин- говых исследований [50–51]. На втором этапе при- меняется метод MAIPA, позволяющий определять специфичность антител. Такой алгоритм дает воз- можность проводить исследования антител более эф- фективно




Читайте также:
Почему люди поддаются рекламе?: Только не надо искать ответы в качестве или количестве рекламы...
Генезис конфликтологии как науки в древней Греции: Для уяснения предыстории конфликтологии существенное значение имеет обращение к античной...
Почему человек чувствует себя несчастным?: Для начала определим, что такое несчастье. Несчастьем мы будем считать психологическое состояние...
Личность ребенка как объект и субъект в образовательной технологии: В настоящее время в России идет становление новой системы образования, ориентированного на вхождение...



©2015-2020 megaobuchalka.ru Все материалы представленные на сайте исключительно с целью ознакомления читателями и не преследуют коммерческих целей или нарушение авторских прав. (833)

Почему 1285321 студент выбрали МегаОбучалку...

Система поиска информации

Мобильная версия сайта

Удобная навигация

Нет шокирующей рекламы



(0.016 сек.)
Поможем в написании
> Курсовые, контрольные, дипломные и другие работы со скидкой до 25%
3 569 лучших специалисов, готовы оказать помощь 24/7