Методы культивирования облигатных внутриклеточных бактерий (риккетсий, хламидий) и вирусов

Выделение чистой культуры аэробных бактерий

В условиях естественного обитания чистые культуры микроорганизмов встречаются довольно редко. Тем не менее, основная часть современных представлений о свойствах бактерий, а также их взаимоотношениях получена при изучении чистых культур. Поэтому совершенно необходимой задачей является выделение чистых культур различных видов бактерий, существующих в естественных условиях. Для выделения чистых культур большинства бактерий обычно затрачивается не более 2-3 суток, однако для некоторых (например, бактерии туберкулеза), этот процесс может затягиваться до 4 - 6 недель.Чистой культурой микроорганизмов называют популяцию бактерий одного вида, представляющую потомство одной клетки.

Методы, применяемые для выделения чистой культуры:

1) Методы, основанные на принципе механического разделения микроорганизмов:

а) механическое разобщение бактериальных клеток на поверхности плотных питательных сред шпателем (по Дригальскому), рассев штрихами калиброванной петлей (по Гольду) или тампоном после забора им исследуемого материала;

б) метод фильтрации, основан на пропускании исследуемого материала через специальные фильтры с определенным диаметром пор и разделение содержащихся микроорганизмов по величине. Этот метод применяется главным образом для очистки вирусов от бактерий, а также при получении фагов и токсинов (в фильтрате - чистый фаг, очищенный токсин).

2) Метод, основанный на получении серийных разведении в жидкой среде с последующим высевом на чашки с агаром (метод пластинчатых разводок по Коху).

3) Методы, основанные на биологических свойствах микроорганизмов:

а) избирательном подавлении размножения сопутствующей микрофлоры при низкой температуре для получения культур психрофильных бактерий;

б) метод Шукевича: клетки бактерий (протея), характеризующиеся скользящим типом движения, засеянные в конденсационную жидкость свежеприготовленного скошенного агара, поднимаются («всползают») по поверхности среды и разрастаются далеко за зону внесения посевного материала;

в) метод прогревания: позволяет отделить спорообразующие бациллы от неспоровых форм. Прогревают исследуемый материал на водяной бане при 80°С 10-15 мин. (При этом погибают вегетативные формы, а споры сохраняются и при посеве на соответствующую питательную среду прорастают);

г) бактериостатический метод (метод ингибирования): основан на различном действии некоторых химических веществ и антибиотиков на микроорганизмы - определенные вещества угнетают рост одних микроорганизмов и не оказывают влияния на другие, например, небольшие концентрации пенициллина задерживают рост грамположительных микроорганизмов и не влияют на грамотрицательные, смесь пенициллина и стрептомицина позволяет освободить нитчатые грибы и дрожжи от бактериальной флоры, серная кислота (5% раствор) быстро убивает большинство микроорганизмов, а туберкулезная палочка выживает в этих условиях;

д) метод заражения лабораторных животных или растений: основан на способности некоторых бактерий быстро размножаться в организме чувствительных к ним лабораторных животных (биопроба); применяют в целях выделения и идентификации патогенных микроорганизмов и отделения их от сапрофитной флоры; для заражения подбирают наиболее восприимчивые к предполагаемому возбудителю инфекции виды животных или сорта растений, после появления у зараженных организмов признаков болезни их убивают и производят посев органов и тканей на питательные среды. При выделении и изучении облигатных паразитов этот метод является основным и единственным.

Методы культивирования облигатных внутриклеточных бактерий (риккетсий, хламидий) и вирусов

Для культивирования вирусов (так же, как и для других облигатных паразитов - риккетсий и хламидий) используют куриные эмбрионы, культуры тканей и лабораторных животных.

Куриный эмбрион - удобная модель для культивирования вирусов в целях получения вирусов и для приготовления диагностических, профилактических и лечебных препаратов - диагностикумов и вакцин. Куриные зародыши используют в возрасте от 8 до 12 дней, перед заражением инфекционным материалом скорлупу яйца над воздушной камерой обрабатывают 70% спиртом, обжигают, смазывают йодом (2% настойка), вторично протирают спиртом и обжигают. Вируссодержащий материал, обработанный для удаления бактериальной флоры, в асептических условиях наносят на хорион-аллантоисную оболочку или вводят в желточный мешок, аллантоисную полость, либо в амнион (ткань эмбриона). После заражения в аллантоисную полость через отверстие заливают парафин; если материалом заражают хорион-аллантоис, отверстие в скорлупе закрывают стерильным покровным стеклом, края которого замазывают парафином. После инфицирования эмбрионы помещают в термостат при 37°С. Признаки репродукции вируса проявляются особенно четко в месте заражения на хорион-аллантоисной оболочке в виде очагов поражения и геморрагий или для его обнаружения применяют специальные реакции (например, реакцию гемагглютинации - РГА).

Культуры клеток (тканей) получают из тканей животных и человека. Их делят на первичные, которые используют в течение одной генерации, и перевиваемые, которые поддерживают путем пассажей (перевивок) длительное время. Клетки перевиваемой культуры ткани готовят из нормальных (чаще эмбриональных) и злокачественных линий клеток, они способны сравнительно прочно прикрепляться к стеклу флакона, образовывать монослой клеток и многократно размножаться in vitro. Для поддержания жизнеспособности клеток применяются специальные синтетические среды (например, среда 199, среда Хэнкса), содержащие аминокислоты, витамины, глюкозу, минеральные соли с добавлением 5 -10% коровьей или лошадиной сыворотки. Трипсин используется при получении культуры клеток для дезагрегации тканей, т.е. для разобщения клеток. Репродукция вирусов в культуре клеток сопровождается так называемым цитопатическим действием (ЦПД), которое проявляется в изменении морфологии клеток и их гибели или образования синцития, а в некоторых случаях - в возникновении в инфицированных клетках клеточных включений. Характер и время проявления ЦПД зависит от вида вируса.

Для создания моделей вирусных инфекционных болезней и выделения вирусов используют лабораторных животных (белых мышей, хомяков, крыс, кроликов и др.). Чувствительность животных к вирусам зависит от вида животного и его возраста.

Культивирование риккетсийРиккетсии являются облигатными паразитами, их культивирование возможно только в живых тканях. Обычно их выращивают в желточном мешке куриного эмбриона.

Культивирование хламидийХламидии можно размножать в желточном мешке куриного эмбриона или в культурах тканей позвоночных. Размножение в куриных эмбрионах происходит в температурных границах 33 - 41°С и даже более широких, но чувствительность к обеим крайним температурам и оптимум для роста варьирует от вида к виду.

Техника посева бактерий на питательные среды, выделение и идентификация чистых культур бактерийЧистую культуру бактерий получают для проведения диагностических исследований - идентификации, которая достигается путем определения морфологических, культуральных, биохимических и других признаков микроорганизмов.

Морфологические и тинкториальные признаки бактерий изучают при микроскопическом исследовании мазков, окрашенных разными методами, и нативных препаратов.

Культуральные свойства характеризуются питательными потребностями, условиями и типом роста бактерий на плотных и жидких питательных средах. Они устанавливаются по морфологии колоний и особенностям роста культуры.

Биохимические признаки бактерий определяются набором конститутивных и индуцибельных ферментов, присущих определенному роду, виду, варианту. В бактериологической практике таксономическое значение имеют чаще всего сахаролитические и протеолитические ферменты бактерий, которые определяют на дифференциально-диагностических средах.

При идентификации бактерий до рода и вида обращают внимание на пигменты, окрашивающие колонии и питательную среду в разнообразные цвета. Например, красный пигмент образуют Serratia marccescens, золотистый пигмент – Staphylococcus aureus (золотистый стафилококк), сине-зеленый пигмент – Pseudomonas aeruginosa (синегнойная палочка).

Для установления биовара (хемовара, серовара, фаговара) проводят дополнительные исследования по выявлению соответствующего маркера-определению фермента, антигена, чувствительности к фагам.

Посев уколом. Посев уколом в агар столбиком применяется для выращивания анаэробов или выявления характерного признака микроба, так как рост по уколу типичен для ряда бактерий. При посеве уколом в столбик желатины наблюдается разжижение ее бактериями, обладающими протеолитическим ферментом. Посев уко­лом в полужидкий агар практикуется также с целью длительного хранения культур.

При посеве уколом пробирку с агаром или столбиком желатины держат дном кверху, вынимают пробку и обжигают край пробирки. Материал, содержащий микробы, забирают обожженной на пламени платиновой иглой и прокалывают ею столбик питательной среды снизу вверх почти до самого дна пробирки

Посев петлей (посев штрихами). Берут одну чашку Петри с питательным агаром и делят ее на 4 сектора, проводя разграничительные линии на внешней стороне дна чашки. Исследуемый материал петлей вносят в первый сектор и проводят ею параллельные линии по всему сектору на расстоянии одна от другой около 5 мм. Этой же петлей, не изменяя ее положения по отношению к агару, проводят такие же линии на других секторах чашки. В том месте, где на агар попало большое количе­ство микробных клеток, рост микроорганизмов будет в виде сплошного штриха. На секторах с небольшим количеством клеток вырастают отдельные колонии.

Выделение чистых культур бактерий по методу Дригальского. Берут 3 чашки Петри с питательной средой. В одну из чашек на питательный агар пастеровской пипеткой или петлей наносят каплю исследуемого материала и растирают стерильным шпателем по всей поверхности агара. Затем шпатель переносят во 2-ю чашку и втирают оставшуюся на шпателе культуру в поверхность питательной среды. Далее шпатель переносят в 3-ю чашку и аналогичным образом производят посев, после чего чашки помещаются в термостат. В последующем, в извлеченных из термостата чашках в зависимости от содержания микробных клеток в исследуемом материале на одной из чашек вырастают отдельные колонии различных бактерий, отличающиеся между собой по форме, цвету, величине, консистенции, пригодные для выделения чистой культуры микроорганизма. Отдельную (изолированную) "подозрительную", интересующую исследователя колонию снимают и засевают на скошенный агар. Из остатка колонии готовят микропрепарат и изучают при окраске по Граму. У выросших на скошенном агаре бактерий (как правило, одного вида) определяют биохимические, тинкториальные, антигенные свойства и делают заключение о выделенной культуре бактерий.

При выделении чистой культуры бактерий по Гольду, внесенной на один из 4-х секторов пластинчатого агара в чашке Петри, материал равномерно штрихами засевается по всему сектору и петля прожигается. Охлажденной петлей материал снимается с одного из штрихов первого сектора и переносится во второй, где производится равномерный штриховой посев, аналогичный первому. В третий и четвертый сектор посев делается соответственно из второго и третьего секторов аналогично засеву второго сектора.

После инкубации в термостате наиболее густой рост бактерий выявляется в области первых штрихов первого сектора. В каждом последующем секторе выявляется менее густой рост бактерий, чем в предыдущем, или рост отдельных колоний. Отдельную колонию отвивают на скошенный агар и идентифицируют по тинкториальным, биохимическим, серологическим свойствам.

Данный метод применяется в тех случаях, когда одновременно с выделением чистой культуры необходимо определить количество бактерий в исследуемом материале. Определение количества бактерий всех видов в 1 г (1 мл) материала производят по числу выросших на соответствующей среде колоний с учетом объема посевного материала и степени его разведения. Количество микроорганизмов в 1,0 г = n'а'b', где n - число колоний, выросших на питательной среде; а - коэффициент посевной дозы (при посеве 0,1 мл а=10, при посеве 0,05 мл а=20); b - степень разведения посевного материала.

Метод серийных разведений (пластинчатых разводок) по Кохутакже применяет для определения количества микробов в исследуемом материале, чаще всего в жидких средах.

Посев по методу Шукевича. Исследуемый материал засевают в конденсационную воду скошенного агара. При размножении подвижные формы микробов из конденсационной воды распространяются по агару, как бы «вползают» на его поверхность. Отсевая верхние края культуры в конденсационную воду свежескошенного агара и повторяя это несколько раз, можно получить чистую культуру.