Колоночная хроматография

Как уже было отмечено выше, колоночная хроматография (КХ) используется, как правило, для препаративного разделения веществ. Этот метод разделения весьма эффективен. Его применяют прежде всего для разделения малых количеств веществ или для соединений, разделение которых классическими методами (перегонка, перекри­сталлизация) невозможно.

Хроматографические колонки представляют собой вертикально закрепленные стеклянные трубки, снабженные краном в нижней части, которые заполняют тонкоизмельченным адсорбентом (неподвижная фаза). Раствор, подлежащий разделению или очистке (подвижная фаза), под действием силы тяжести стекает по колонке вниз (нисходящая КХ) или под действием капиллярных сил подни­мается вверх (восходящая КХ).

Отдельные соединения в зависимости от их сродства к адсорбен­ту и растворителю адсорбируются в различной степени (или, соот­ветственно, с различной скоростью проходят сквозь колонку). Из­влекают отдельные "зоны" из колонки, продолжая промывание ко­лонки элюентом.

Рекомендуется использовать 25-30 г адсорбента на 1 г адсорби­руемого материала (и 100-1000 г адсорбента, если образец обладает слабой адсорбцией или если приходится работать с небольшим ко­личеством - порядка миллиграммов - адсорбируемого материала). Оптимальный размер гранул адсорбента 100-150, 150-200 мк.

С уменьшением размеров гранул разделительная способность сорбента возрастает, однако вместе стем возрастает и гидродина­мическое сопротивление всей колонки (очень снижается скорость хроматографирования). [15]

Заполнение хроматографических колонок. Наиболее оптималь­ными являются трубки следующих размеров: 15*1, 25*2, 40*3, 60*4см. Простейшим примером хроматографической колонки является бюретка. В нижнюю часть трубки вставляется неплотный тампон из обычной или стеклянной ваты. Заполнение колонок адсорбентом проводят двумя способами мокрым и сухим. И в том и в другом случае основное требование - равномерное наполнение хроматографической колонки. [3]

Сухой способ: в колонку постепенно засыпают предварительно просеянный адсорбент, осторожно постукивая стеклянной палочкой с резиновым наконечником по колонке. После того, как весь адсор­бент засыпан, сверху помещают тампон (или кружочек фильтро­вальной бумаги) для того, чтобы при введении раствора анализи­руемой смеси и добавлении элюента не происходило взмучивание верхнего слоя адсорбента. [4]

Мокрый способ: приготавливают суспензию необходимого ко­личества адсорбента в растворителе, которым будет осуществляться элюирование. Если элюент состоит из смеси растворителей, то для этих целей используют менее полярный растворитель, входящий в состав элюента. Суспензию медленно вливают в хроматографическую колонку (при постукивании). Можно также сухой адсорбент засыпать в колонку, наполненную растворителем. При этом необ­ходимо следить за тем, чтобы в объеме не было пузырьков воздуха. По мере заполнения колонки избыток элюента сливают через ниж­ний кран. К концу заполнения колонка над поверхностью адсорбен­та должен быть слой элюента около 2-3 мм. [4]

При заполнении колонки и в процессе элюирования необходимо следить за тем, чтобы хроматографическая колонка ни на секунду не оставалась "сухой" (без слоя растворителя над адсорбентом), так как в противном случае в слое адсорбента образуются трещины. [14]

В подготовленную колонку вносится анализируемая смесь. Здесь тоже можно выделить два способа введения - "сухой" и "мокрый". Причем использовать можно и тот и другой независимо от способа заполнения колонки адсорбентом. Чаще всего хроматографируемую смесь вносят в виде концентрированного раствора (максимально возможной концентрации), причем для растворения используют менее полярный растворитель, стоящий в элюотропном ряду перед растворителем, которым будут проводить элюирование, или менее полярный компонент смешанного элюента. Как только раствор впитается, начинают добавлять элюент. [6]

В "сухом" варианте анализируемую смесь предварительно нано­сят на небольшое количество адсорбента. Для этого в отдельной колбочке смешивают адсорбент и раствор анализируемой смеси (в данном случае концентрация раствора не имеет значения), затем растворитель удаляют на вакуумном испарителе. Полученную та­ким образом сухую смесь адсорбента и анализируемых веществ пе­реносят в хроматографическую колонку на "линию" старта.

Элюирование. Скорость движения раствора в колонке не должна быть слишком большой, чтобы достигалось адсорбционное равно­весие (для колонки высотой 40 см примерно 3-4 мл/мин). Скорость регулируют с помощью крана на выходе из колонки или уменьшая скорость поступления жидкости на колонку. Если элюат стекает слишком медленно, давление в колонке несколько повышают. Для этого увеличивают слой жидкости над адсорбентом либо поддавли­вают с помощью компрессора. Элюат собирают фракциями по 0,5-10 мл. Соответствующими аналитическими методами определяют, содержится ли в этих фракциях хроматографическое вещество. Чаще всего хроматографируют в тонком слое каждую фракцию элюата. [6]

Если применяемый растворитель не вызывает элюирования ад­сорбированного вещества или же после вымывания одного вещества появляются фракции, содержащие только растворитель, надо повы­сить элюотропную способность растворителя. Для этого постепенно добавляют (начиная с 1-2%) к применяемому растворителю другой, расположенный ниже в элюотропном ряду, и контролируют, элюируется ли из колонки следующее вещество. Этот процесс (разбавление растворителя и элюирование) продолжают до тех пор, пока из колонки не будут извлечены все компоненты, введенные с исходным растворителем. [19]

Описанные приемы хроматографирования не исчерпывают всего многообразия методов колоночной и тонкослойной адсорбционной хроматографии, хотя и являются наиболее широко используемыми.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РАБОТЫ