Актуальность проблемы

С каждым годом все больше внимания уделяется проблемам загрязнения окружающей среды. Нефть и нефтепродукты — наиболее распространенные загрязнители, нарушающие и угнетающие все жизненные процессы: они подавляют дыхательную активность и микробное самоочищение, изменяют естественное соотношение численности микроорганизмов, меняют направление
обмена веществ, накапливаются в виде трудноокисляемых продуктов. Эта проблема стоит остро не только для нефтедобывающих и нефтеперерабатывающих регионов; любой город может столкнуться с нефтезагрязнением, поскольку хранилища горюче-смазочных материалов распространены повсеместно. В этой связи очень актуальна разработка эффективных способов биологической очистки нефтезагрязненных почв для конкретных регионов.

К сожалению, для современной цивилизации вполне привычными стали экологические катастрофы, связанные с наземными разливами нефтепродуктов. Немалая доля таких происшествий связана с авариями на нефтехранилищах. При этом даже после прекращения действия таких нефтехранилищ они на долгие годы остаются источниками загрязнений. По степени отрицательного влияния нефть и нефтесодержащие промышленные отходы, в том числе и пластик, занимают второе место после радиоактивного загрязнения. Несовершенство технологий добычи, транспортировки, переработки и хранения нефти приводит к ее значительным потерям, которые достигают 50 млн. т/год, то есть 2% от общей добычи.

С неуклонным ростом плотности автотранспорта на территории городов увеличивается число заправочных станций и обслуживающих пунктов, а это, в свою очередь, повышает вероятность возникновения разливов нефтепродуктов и создает пожаро- и экологически опасную ситуацию. В настоящее время эти загрязненные территории не подвергаются обработке. Процесс естественного самовосстановления загрязненной среды является очень длительным: при уровне загрязнения 5 г/кг почвы он длится от 2 до 30 лет и выше. В связи с этим, остро стоит вопрос разработки экологически безопасных и экономически обоснованных мероприятий, направленных на интенсификацию процессов биологической очистки и восстановления плодородия земель.

На данный момент существует три способа очистки воды: механический, физико-химический и биологический. Механическая очистка подразумевает отстаивание и фильтрацию загрязнений, что, во-первых, не решает проблему очистки от растворенных элементов, а, во-вторых, не решает проблему утилизации самих загрязнений, которые остаются практически в неизмененном виде. Пример физического способа очистки — сжигание и термическая десорбция (крекинг). Но при сжигании из-за недостаточно высокой температуры в атмосферу попадают продукты возгонки и неполного окисления нефти. Землю после сжигания необходимо вывозить на свалку (так называемая «горелая земля»). Химическая очистка, хотя и решает проблему очистки от растворенных соединений, опять же не решает проблему утилизации отходов. Биологический ущерб от применения диспергаторов оказался больше, чем ущерб, который можно было ожидать от загрязнения только нефтью, так как эти соединения довольно токсичны. Кроме того, необходимо учесть высокую стоимость самих реактивов и необходимость их точной дозировки .

На первое место сейчас выходит биоремедиация (bio — жизнь, remedio — лечение) — очищение природной среды от загрязнений при помощи биологических методов. При этом необходимо исходить из главного принципа: не нанести экосистеме больший вред, чем тот, который уже нанесен при загрязнении. Это может быть биостимуляция аборигенной микрофлоры путем внесения удобрений непосредственно в загрязненную экосистему или внесение специализированных препаратов микроорганизмов, созданных для очистки загрязненных экосистем.

Использование нефтеокисляющих микроорганизмов для очистки окружающей среды является не новой, но недостаточно изученной областью исследований. Продолжается поиск новых деструкторов углеводородов нефти и выявление оптимальных условий эффективного использования имеющихся препаратов.

Нефть (через тур. neft, от перс. naft; восходит к аккадскому напатум — вспыхивать, воспламенять) — природная горючая маслянистая жидкость со специфическим запахом, распространенная в осадочной оболочке Земли. Нефть представляет собой смесь около 1000 индивидуальных веществ, из которых большая часть — жидкие углеводороды (УВ) (> 500 веществ; 80–90% по массе) и гетероатомные органические соединения (4–5%), преимущественно сернистые (около 250 веществ), азотистые (> 30 веществ) и кислородсодержащие (около 85 веществ), а также металлоорганические соединения (в основном ванадиевые и никелевые). Минорные компоненты — растворённые углеводородные газы (C1—C4; 0.1–4%),вода (0–10%), минеральные соли (главным образом хлориды; 0.1–4000 мг/л и более), растворы солей органических кислот и механические примеси (частицы глины, песка, известняка).

Легкая фракция нефти (наиболее подвижная часть) включает низкомолекулярные алканы, нафтены и ароматические УВ. Метановые УВ, находясь в почвах, водной или воздушной средах, оказывают наркотическое и токсическое действие на живые организмы. Особенно быстро действуют нормальные алканы с короткой углеводородной цепью. Они лучше растворимы в воде, легко проникают в клетки организмов через мембраны, дезорганизуют цитоплазматические мембраны организма. Легкая фракция мигрирует по почвенному профилю и водоносным горизонтам, значительно расширяя ареал первичного загрязнения.

Ароматические УВ — наиболее токсичные компоненты нефти: в концентрации всего 1% в воде они убивают все водные растения. Бензол и его гомологи оказывают более быстрое токсическое действие на организм, чем полициклические ароматические углеводороды (ПАУ). Последние действуют медленнее, но более длительное время, являясь хроническими токсинами. В основе практически всех техногенных источников ПАУ лежат термические процессы, связанные со сжиганием и переработкой органического сырья: нефтепродуктов, угля, древесины, мусора, пищи, табака и др. Такие соединения, как бенз[a]антрацен, бенз[a]пирен и овален, обладают ярко выраженными канцерогенными, мутагенными и тератогенными свойствами.

Еще одна фракция нефти — парафины — сама по себе не токсична для живых организмов и в условиях земной поверхности переходят в твердое состояние, лишая нефть подвижности. Твердый парафин очень трудно разрушается, с трудом окисляется на воздухе. Он надолго может «запечатать» все поры почвенного покрова, лишив почву возможности свободного влагообмена и дыхания, что, в конечном счете, приводит к полной деградации биоценоза.

Вредное экологическое влияние смолисто-асфальтеновых компонентов на почвенные экосистемы заключается не в химической токсичности, а в значительном изменении водно-физических свойств почв. Если нефть просачивается сверху, ее смолисто-асфальтеновые компоненты сорбируются в основном в верхнем, гумусовом горизонте иногда прочно цементируя его. При этом уменьшается поровое пространство почв. Обволакивая корни растений, они резко ухудшают поступление к ним влаги, в результате чего растения погибают. Эти вещества малодоступны микроорганизмам, процесс их метаболизма идет очень медленно — иногда десятки лет

Ранее предполагалось, что микроорганизмы, способные разлагать и использовать углеводороды нефти и нефтепродуктов, встречаются только там, где расположены нефтепромыслы, нефтехранилища или нефтепроводы, однако, согласно современным данным, микроорганизмы-нефтедеструкторы распространены в природе очень широко и могут быть выделены из любой почвы, осадочных пород, морской и речной воды. Эти гетеротрофные микроорганизмы могут усваивать разнообразные органические соединения — углеводы, белки, жиры и пр. Численность микроорганизмов-нефтедеструкторов в естественных биоценозах в немалой степени определяется климатическими условиями, типом почв, степенью их обработки, глубиной залегания грунтовых вод. (Необходимо отметить, что некоторые морские микроорганизмы приспособились использовать в пищу даже полиэтилен, еще недавно считавшийся практически неразлагающимся в природе: «Пластик на завтрак».

В большинстве случаев метаболизм парафиновых углеводородов начинается с окисления терминальной метильной группы в спирт и, далее, через альдегид до соответствующей жирной кислоты. Дальше процесс идет по пути β-окисления жирных кислот, при котором за каждый цикл длина цепочки жирной кислоты укорачивается на два углеродных атома. Как правило, ферменты, участвующие в этом процессе, обладают низкой специфичностью и могут участвовать в утилизации углеводородов с различным числом углеродных атомов. Конечные продукты метаболизма нефти в почве следующие:

углекислота (связывается в составе карбонатов) и вода;

кислородсодержащие соединения (спирты, кислоты, альдегиды, кетоны), которые частично входят в почвенный гумус, частично растворяются в воде и удаляются из почвенного профиля;
Так, главный продукт окисления нафталина — салициловая кислота; антрацена — 3-гидрокси-2-нафтойная; фенантрена — 1-гидрокси-2-нафтойная; хризена — гидроксифенантренкарбоновая и бензо[a]пирена — гидроксипиренкарбоновая кислоты.

твердые нерастворимые продукты метаболизма — результат дальнейшего уплотнения высокомолекулярных продуктов или связывания их в органо-минеральные комплексы;

твердые корочки высокоминеральных компонентов нефти на поверхности почвы (киры).

Именно химический и композиционный состав отдельных компонентов нефти определяют особенности утилизации их микроорганизмами. Решающее значение для использования алифатических углеводородов имеет длина цепи: по мере удлинения цепи парафинов растет число видов микроорганизмов, способных использовать эти соединения, а также активность их использования. После первичной атаки микроорганизмов в нефтезагрязненной среде остаются алканы с очень длинной цепью, полициклические нафтены, полиароматические углеводороды и смеси веществ, составляющие фракцию смол и асфальтенов. Все эти вещества не могут быть метаболизированы отдельными микроорганизмами, и их деструкция в природных условиях связывается с действием смешанных популяций микроорганизмов, — сообществ, для которых характерны отношения кооперации и взаимопомощи.

Кооперация — это уникальные взаимоотношения между метаболически разными типами бактерий, которые зависят друг от друга при разрушении субстратов. По характеру взаимосвязей можно выделить несколько таких сообществ, в которых ассоциация микроорганизмов становится более эффективной, чем отдельно взятые виды:

§ в которых непосредственные деструкторы углеводородов не способны к синтезу тех или иных компонентов, необходимых для роста (например, витаминов), и этот дефицит покрывается за счет метаболической активности других членов сообщества;

§ в других сообществах некоторые метаболиты, в какой-либо мере подавляющие рост организма-деструктора, удаляются остальными членами сообществ;

§ в некоторых сообществах осуществляется передача восстановительных эквивалентов от одной популяции другой. При этом за счет активности акцепторного организма становится возможным анаэробное разрушение ароматических соединений другими микроорганизмами.

Оптимальная скорость переноса метаболитов достигается в случае тесного контакта партнёров: непосредственного соседства, образования агрегатов или «флокков». Также для описания различных коопераций микроорганизмов используется термин консорциум.

При этом необязательно чтобы консорциум состоял только из нефтедеструкторов. Возможно, наиболее эффективным будет взаимодействие нескольких активных нефтедеструкторов, ориентированных на разные фракции нефти, и нескольких гетеротрофных микроорганизмов, не обладающих углеводородокисляющей способностью, но способных ассимилировать продукты промежуточного окисления углеводородов, часто токсичных для углеводородокисляющих организмов. Проблема создания подобных консорциумов состоит в том, что очень сложно оценить потенциал углеводородокисляющих ферментных систем, а также трофические связи внутри сообщества. Необходимо отметить, что создание универсального биопрепарата (консорциума микроорганизмов, спроектированного специально для задач биоремециации) невозможно по ряду причин :

• во-первых, нефти разных месторождений отличаются друг от друга по фракционному и композиционному составу;
• во-вторых, в практике биоремедиации приходится сталкиваться не только с нефтяными загрязнениями, но и с загрязнениями нефтепродуктами, которые резко отличаются по химическим свойствам от исходной нефти;
• в-третьих, районы добычи, переработки и хранения нефти и нефтепродуктов значительно отличаются друг от друга по природно-климатическим и гидротермическим условиям.

§ Большой популярностью пользуются микробные препараты, предлагаемые в широком ассортименте биотехнологическими компаниями Европы, США и Японии. Однако, как свидетельствует практика, применение заполнивших российский рынок зарубежных бакпрепаратов, разработанных для районов, по климатическим и экологическим условиям резко отличающихся от регионов России, оказывается малоэффективным. Среди отечественных препаратов наибольшую известность получили «Деворойл», «Ленойл», «Путидойл», «Белвитамил», «Нафтокс», «Биоприн». Эти препараты разрешены к применению Государственным Комитетом санитарно-эпидемиологического надзора при Президенте РФ и экспертной комиссией главного управления государственной экологической экспертизы Минприроды России.

§ В результате биологической обработки нефтяного загрязнения биопрепаратами в окружающей среде остаются легко разлагающийся бактериальный белок, не требующий последующей утилизации, и нетоксичные продукты разложения нефти. Продукты жизнедеятельности бактерий и сами отмирающие бактерии легко усваиваются аборигенной микрофлорой, давая основу для формирования гумуса (при использовании препарата для очистки почвы) или образуя донный ил (в случае применения на воде). Степень очистки зависит от исходной величины загрязнения, вида нефтепродукта, механического состава грунта.

Цель:изучение физиологических особенностей сообщества микроорганизмов-нефтедеструкторов неизвестного состава

Для достижения поставленной цели решались следующие основные задачи:

Периодическое культивирование культуры микроорганизмов

Микроскопирование исследуемых штаммов

Исследование роста культур на различных средах.

1. Методы:

1.Микроскопия в светлом поле. Приготовление препаратов в светлом поле.

2.Окраска клеток по Граму. Определение размеров клеток.

3.Метод накопительных культур.

4.Количественный учет микроорганизмов методом Коха.

5.Изучение чувствительности микроорганизмов к антибиотикам.

Ход работы:

Посевной материал был взят из подземного хранилища радиактивных отходов ГХК (2009 г.)

Методом накопительных культур выделили чистую культуру.

Температурный оптимум – 30 ⁰С

По данным микроскопии была определена морфология бактерий: клетки палочковидной и кокковидной формы.

В ходе окраски клеток по Граму было установлено, что бактерии грамоотрицательны (дав розовую окраску доп-го красителя фуксина).

Для количественного учета микроорганизмов методом Коха:

Подготовлена агаризованная среда следующего состава:

NH4NO3-2 г/л

(NH2)2CO-0,5 г/л

K2HPO4-1 г/л

KH2PO4-0,6 г/л

CaCl2-0,01 г/л

FeSO4-0,01г/л

MgSO4-0,2 г/л

Na2CO3-0,5 г/л

Др. экстракт- 0,1 г/л

Агар-агар – 10 г/л, а так же – NaCl, 0,9 % р-р, глюкоза, 10 г/л, масло вакуумное ВМ 4:

2.Среда и все растворы, а также масло были простерилизованы при р= 2 атм ( t = 120 ⁰С )

3.Среда была разлита в стерильные чашки Петри и оставлена на охлаждение.

4.Перед охлаждением в 6 чашек было добавлено по 0,5 мл масла ВМ-4, а в остальные 6- по 4 мл раствора глюкозы ( 10 г/л).

5.Физ. раствор стерилизовался в пробирках , по 5 мл в каждой. В нем были приготовлены разведения исходной культуры от 10 до 10⁶ раз.

6.На остывшую среду были высеяны последние 3 разведения в двух повторностях и оставлены культивироваться в термостате при 30 ⁰С.
Результаты:

Спустя 4дня выросли 4-е разведение (среда с глюкозой) и 6-е (среда с маслом).

Описание колонии: поверхность круглая гладкая матовая с ровными краями, размер колонии- 2-3 мм( в среде с маслом- 1-2 мм), молочно-бежевого цвета, по консистенции - вросшая в агар.

4-е разведение (среда с глюкозой)- 1: 10000

Среднее количество колоний: 48

N=48 * 10⁴/0,1 = 4,8 * 10⁶

6-е разведение (среда с маслом): 1/1000000

Среднее количество колоний-32

N=32 * 10⁶/0,1 = 32 * 10⁷

N- количество микроорганизмов в 1 мл суспензии

определение чувствительности к антибиотикам ( оксолин, левомицетин, ломефлоксалин) показало, что данный вид микроорганизмов к ним абсолютно устойчив.

Вывод

В ходе самостоятельной работы были изучены морфолого-культуральные и физиологические особенности микроорганизмов-нефтедеструкторов неизвестного состава. Были применены навыки экспериментальных микробиологических исследований, правильного использования освоенных на практических занятиях методов при выполнении исследований в решении практических задач. Произведено ознакомление с требованиями к оформлению результатов научных исследований.

Российский Химико-Технологический Университет им. Д.И. Менделеева

Кафедра биотехнологии