Определение общих и термотолерантных колиформных бактерий методом мембранной фильтрации

К общим колиформным бактериям относятся грамотрицательные не образующие спор палочки, не обладающие оксидазной активностью, ферментирующие лактозу или маннит с образованием альдегида, кислоты и газа при температуре 37°С в течение 24-48 часов. Общие колиформы представляют широкую группу микроорганизмов семейства Enterobacteriaceae, включающую наряду с E. coli микроорганизмы родов Klebsiella, Enterobacter, Citrobacter, которые также могут находиться в кишечнике. Колиформный тест применяется как индикатор очистки и санитарного состояния водоснабжения. Обнаружение общих колиформных бактерий свидетельствует о недостаточной очистке воды.

Термотолерантные колиформные бактерии обладают всеми признаками общих колиформных бактерий, которые также способны ферментировать лактозу до кислоты, альдегида и газа, но при температуре 44°С в течение 24 часов. В группу термотолерантных колиформных бактерий входит род Escherichia, а также отдельные виды родов Klebsiella, Enterobacter, Citrobacter. Термотолерантные колиформные бактерии рассматриваются как показатели фекального загрязнения.

Метод основан на фильтрации установленного объёма воды через мембранные фильтры, выращивании посевов на селективной питательной среде с лактозой и последующей идентификации колоний по культуральным и биохимическим свойствам.

Для качественного анализа используют воду в объёме 100 мл. Этот объём воды фильтруют через нитроцеллюлозный мембранный фильтр. Для этих целей используют фильтры с диаметром пор 0,45 мкм. Перед фильтрованием фильтр помещают в дистиллированную воду и кипятят 15-20 минут. Обработанный таким образом фильтр помещают блестящей поверхностью вниз на сетку фильтра Зейтца, вставленного в колбу Бунзена. В воронку наливают исследуемый объём воды и фильтруют с помощью водоструйного насоса или аппарата Комовского. После фильтрования фильтр переносят стерильным пинцетом на чашку Петри со средой Эндо. Чашки с фильтрами помещают на сутки в термостат дном вверх и инкубируют посевы при температуре 37°С (определение общих колиформных бактерий).

Для определения термотолерантных бактерий посев инкубируют при температуре 44°С в течение 24 часов.

Учёт результатов.

Результат считается отрицательным, если на фильтрах нет роста колоний или отмечен рост пленчатых, губчатых, плесневых, прозрачных и расплывчатых колоний. При наличии типичных лактозоположительных колоний, дающих отпечаток на обратной стороне мембранного фильтра и среде – темно-красных, красных с металлическим блеском и без него, выпуклых с красным центром и других оттенков, а также лактозоотрицательных – розовых без отпечатков, подсчитывают число колоний каждого типа.

Для идентификации отбирают колонии каждого вида, делают их посев на скошенный МПА или на чашки секторами, инкубируют при температуре 37°С 16-18 часов.

Все дальнейшие биохимические тесты проводят только с чистыми культурами.

В качестве подтверждающих тестов используют оксидазный тест и тест образования кислоты и газа при ферментации лактозы или маннита.

Тест на оксидазную активность проводят с помощью системы индикаторной бумажной (СИБ). СИБ для определения оксидазной активности представляет собой хроматографическую бумагу, пропитанную растворами диметил-парафенилендиамина и α-нафтола. Цвет индикаторных полосок серовато-фиолетовый.

Механизм реакции: оксидаза, продуцируемая микроорганизмами, обуславливает взаимодействие между диметил-парафенилендиамином и

α-нафтолом, при этом образуется индофенол синий, окрашивающий культуру в синий цвет.

Постановка оксидазного теста: часть изолированной колонии изучаемой культуры петлей наносят на пропитанную реактивом фильтровальную бумагу, помещенную в чашку Петри. Если в течение 1 мин. появляется фиолетово-коричневое окрашивание, культура считается оксидазоположительной и дальнейшему изучению не подлежит. Если реакция на оксидазу отрицательная (цвет на месте нанесения культуры не меняется), культура подлежит дальнейшему исследованию. Оксидазоотрицательные колонии засевают в пробирки с полужидкой лактозной средой.

Полужидкая среда с лактозой или маннитом (глюкозой): в 1 л дистиллированной воды растворяют 10 г пептона, 5 г NaCl, 4-5 г агар-агара, доводят до кипения, устанавливают рН 7,2-7,4, добавляют 1 мл 1,6% спиртового раствора бромтимолового синего. Стерилизуют при 120°С 20 минут. В расплавленную среду вносят 5 г лактозы или маннита (глюкозы), нагревают до кипения, разливают в стерильные пробирки на высоту 3-5 см и стерилизуют при 112°С 10 минут. Правильно приготовленная среда – зеленого цвета с синеватым оттенком (цвет бутылочного стекла).

Посев производят уколом до дна пробирки. При образовании кислоты цвет среды изменяется в жёлтый, при газообразовании газ скапливается или по уколу, или на поверхности, или в толще среды появляются разрывы.

Для определения общих колиформных бактерий посев инкубируют при 37°С, для определения термотолерантных колиформных бактерий посев инкубируют при 44°С в течение 24 часов.

Грамотрицательные колонии учитывают как общие колиформные бактерии при отрицательном оксидазном тесте, ферментации лактозы при температуре 37°С с образованием кислоты и газа. Грамотрицательные колонии учитывают как термотолерантные колиформные бактерии при отрицательном оксидазном тесте и ферментации лактозы при температуре 44°С с образованием кислоты и газа.