Методика проведения микроскопирования

В молочной промышленности микроскопические исследования проводят при изучении микроморфологических особенностей микрофлоры молока, лабораторных и производственных заквасок, продуктов переработки молока. Метод основан на визуальном наблюдении микроорганизмов с помощью приборов (микроскопов), позволяющих многократно увеличивать подготовленный исследуемый объект.

При микроскопическом исследовании учитываются как жизнеспособные, так и нежизнеспособные клетки микроорганизмов, при этом чувствительность метода - не менее 10 клеток в 1 см или 1 г исследуемого продукта.

Метод предназначен для установления соответствия микробиологических показателей качества пищевых и кисломолочных продуктов, заквасок, бактериальных концентратов и бактериальных препаратов молочнокислых бактерий требованиям нормативно-технической документации.

Исследование проводится в соответствии с ГОСТ 10444.11-89. «Продукты пищевые. Методы определения молочнокислых микроорганизмов» и ГОСТ Р 53430-2009. «Молоко и продукты переработки молока. Методы микробиологического анализа».

Отбор проб и подготовка образцов проводятся согласно ГОСТ Р 53430-2009 «Молоко и продукты переработки молока. Методы микробиологического анализа» и ГОСТ 26809-86
«Молоко и молочные продукты. Правила приемки, методы отбора и подготовка проб к анализу»:

- Отбор проб для микробиологических анализов проводят перед отбором проб для физико-химических и органолептических анализов.

- Контроль осуществляют путем анализа пробы, отобранной из транспортной или потребительской тары с продукцией, попавшей в выборку. Объем выборки для конкретного наименования продукта установлен требованиями ГОСТ 26809.

- Перед вскрытием тары с продукцией крышки фляг, цистерн, банок и т. д. очищают от загрязнений, промывают и протирают.

- Пробу для анализа отбирают взвешиванием (для сгущенных, полутвердых, твердых и сухих продуктов) или измерением объема (для жидких продуктов).

- Пробы для микробиологических анализов отбирают в стерильную посуду с помощью стерильных приспособлений.

- Жидкие кисломолочные продукты в потребительской таре перемешивают в зависимости от консистенции продукции путем пятикратного перевертывания бутылки, пакета или шпателем около 1 мин. после вскрытия тары. После перемешивания необходимое для исследования количество продукта отбирают стерильной пипеткой и помещают в стерильную посуду, которую затем закрывают стерильной пробкой.

Подготовка проб к анализу:

6.3.1 Молоко, сливки

Отобранные пробы перед исследованием тщательно перемешивают.

6.3.2 Кисломолочные и сквашенные продукты, сметана, закваски

Отобранные пробы перед анализом перемешивают и нейтрализуют.

Для этого в стерильную колбу вместимостью 50 см³ стерильно отбирают (10,0 ± 0,1) г/см³ исследуемого продукта или закваски и добавляют 1 см³ стерильного раствора двууглекислого натрия, приготовленного по 6.2.10, содержимое перемешивают.

Подготовка к проведению анализа:

1) Приготовление микропрепарата.

Для приготовления препарата жидкого продукта по 6.3.1 и 6.3.2 на чистое предметное стекло наносят петлей каплю продукта и распределяют на площади 1-2см².

Приготовленные микропрепараты высушивают при комнатной температуре на воздухе.

2) Фиксирование микропрепарата.

Для закрепления клеток микроорганизмов на стекле высушенные микропрепараты фиксируют. Для этого предметное стекло с высушенным микропрепаратом, обращенным вверх, берут пинцетом и проводят 3-5 раз через верхнюю часть пламени горелки с промежутками в 5-6 с. Зафиксированный микропрепарат охлаждают на воздухе.

3) Окрашивание микропрепарата.

Согласно ГОСТ окрашивание микропрепарата может проводиться тремя способами:

- 8.7.2.3 Окрашивание микропрепарата метиленовым голубым

Зафиксированный микропрепарат помещают на подставку для окраски мазком вверх. Пипеткой наносят рабочий раствор метиленового голубого так, чтобы покрыть весь мазок, по истечении 30—60 с краситель осторожно сливают. Препарат промывают водой.

Окрашенный мазок высушивают на воздухе.

- 8.7.2.4 Окрашивание микропрепарата по Граму

Зафиксированный микропрепарат помещают на подставку для окраски мазком вверх, накладывают полоску фильтровальной бумаги и наливают раствор кристаллического фиолетового. Окраску проводят в течение 1—2 мин.

Снимают бумагу, сливают избыток красителя и, не промывая препарат водой, наливают раствор Люголя на 1—2 мин до почернения препарата.

Раствор Люголя сливают. Предметное стекло погружают несколько раз в этиловый спирт. Процесс обесцвечивания считается завершенным, когда от мазка перестают отделяться окрашенные в фиолетовый цвет струйки жидкости.

Микропрепарат тщательно промывают водой.

Повторную окраску микропрепарата проводят водно-спиртовым раствором фуксина в течение 2 мин.

- 8.7.2.5 Подготовка микропрепаратов и окраска по Граму в модификации Г.П. Калины

На предметное стекло в каплю воды с внесенной агаровой культурой вносят петлей каплю реактива 1, приготовленного по 6.2.12.1^[1]. Смесь распределяют на площади 1—2 см², просушивают при (20 ± 2) °С и фиксируют. Препарат ополаскивают водой и тщательно просушивают фильтровальной бумагой.

После просушивания на препарат наносят с избытком реактив 2, приготовленный по 6.2.12.2^[2], чтобы жидкость покрывала всю поверхность стекла. Продолжительность окрашивания — 30—60 с. После окрашивания препарат ополаскивают проточной водой, направляя струю под углом на стекло, помещенное вертикально. Препарат просушивают фильтровальной бумагой.

Грамположительные микроорганизмы приобретают темно-фиолетовый цвет, а грамотрицательные — красный цвет.

Проведение анализа.

Просушенный микропрепарат помещают на предметный столик микроскопа и просматривают микропрепарат, используя иммерсионную систему.