Длина теломерной ДНК и активность теломеразы в клетках человека

(Богданов А.А., 1998)

Тип клеток	Длина теломерной ДНК, тыс. п.н.	Теломеразная активность
Половые Соматические Раковые	15-20 10-12 при рождении, уменьшается с возрастом 4-6, 10-15	Высокая Отсутствует Присутствует в 80% случаев

Транскрипция

 

Транскрипцией называют биосинтез РНК на матрице ДНК. Это первая стадия реализации генетической информации, в процессе которой определенные участки нуклеотидной последовательности ДНК «переписываются» в комплементарные одноцепочечные молекулы РНК. В результате транскрипции образуются мРНК, кодирующие аминокислотные последовательности белков, тРНК, рРНК и другие виды РНК, выполняющие структурные, регуляторные и каталитические функции.

Принципы транскрипции

Транскрипция во многом сходна с репликацией. В основе механизма копирования при транскрипции лежит фундаментальный принцип комплементарности азотистых оснований полинуклеотидных цепей ДНК и РНК. Как и при синтезе ДНК, субстратами синтеза РНК являются рибонуклеозидтрифосфаты. В ходе включения в строящуюся цепь они теряют пирофосфатные остатки, что обеспечивает процесс энергией. Еще одно сходство с синтезом ДНК состоит в направлении роста строящейся цепи: 5′®3′, т. е. очередные нуклеотиды присоединяются к 3′-концу. Как и при всех матричных синтезах, строящаяся цепь антипараллельна матричной цепи ДНК.

Однако имеются и принципиальные отличия от синтеза ДНК. Транскрипция – ассиметричный процесс, в качестве матрицы используется лишь одна молекула ДНК, получившая название матричной или значащей. Синтез РНК не требует для своего начала никакой затравки. Процессу транскрипции подвергается единовременно не вся молекула ДНК, а только ее определенные участки – транскриптоны. Они ограничены двумя последовательностями, которые называются промотором (зона начала транскрипции) и терминатором (зона остановки транскрипции). Транскриптоны бактерий (опероны) обычно включают несколько структурных генов (цистронов). Поэтому синтезируемая на оперонах бактерий мРНК является полицистроновой и может быть использована для синтеза нескольких белков, в отличие от моноцистроновых мРНК эукариот, служащих матрицами для синтеза одного определенного белка.

 

 

РНК-полимеразы

Процесс транскрипции осуществляется с участием ферментов – РНК-полимераз, а также большой группы белков – регуляторов транскрипции.

У прокариот молекула РНК-полимеразы состоит из двух компонентов:

· минимальной РНК-полимеразы, или «кор»-фермента (от англ. core – серцевина), содержащей все каталитические центры, участвующие в синтезе РНК;

· σ-субъединицы, необходимой для правильного присоединения фермента к промотору и отделяющейся от РНК-полимеразы после начала синтеза РНК.

Комплекс минимального (сore-) фермента и σ-субъединицы называется холоферментом. Core-фермент имеет одинаковое сродство к любой последовательности нуклеотидов (рис. 29а). Только полный (holo-) фермент обладает высоким сродством к промотору, сродство к остальным случайным последовательностям ДНК у него снижено в 10 тыс. раз
(рис. 29б).

 

 

Рис. 29. Инициация транскрипции ДНК бактериальной РНК-полимеразой

Как только произошла инициация транскрипции, σ-фактор отделяется. Элонгация (продолжение синтеза РНК) и терминация (остановка транскрипции) осуществляются core-ферментом. Минимальная РНК-полимераза состоит из четырех субъединиц: двух идентичных α-субъединиц и неидентичных β- и β′-субъединиц.

В ядрах эукариот обнаружены три специализированные формы РНК-полимеразы:

· РНК-полимераза I синтезирует рибосомные РНК (28S и 18S);

· РНК-полимераза II – матричные РНК;

· РНК-полимераза III – транспортные и низкомолекулярные рибосомные РНК (5S).

Этапы транскрипции

1. Инициация – первый этап транскрипции, в ходе которого происходит связывание РНК-полимеразы с промотором и образование первой межнуклеотидной связи.

У бактерий холофермент РНК-полимераза непосредственно узнает определенные последовательности нуклеотидных пар в составе промотора: последовательность 5′-ТАТААТ-3′ (расположена на расстоянии 10 нуклеотидов от точки начала транскрипции и называется боксом Прибнова) и последовательность 5′-ТТГАЦА-3′ (удалена от точки начала транскрипции на 35 нуклеотидов). В некоторых оперонах, например в лактозном, необходимо предварительное взаимодействие с промотором дополнительного белка (САР изменяет структуру промотора, резко повышая его сродство к РНК-полимеразе).

РНК-полимеразы эукариот не способны самостоятельно связываться с промоторами транскрибируемых генов. В присоединении к транскриптонам РНК-полимераз принимают участие общие факторы транскрипции (TF). Они отличаются от σ-факторов прокариот тем, что могут связываться с ДНК независимо от РНК-полимеразы. Полимеразы I, II и III требуют присутствия разных факторов транскрипции, обозначаемых TF I, TF II и TF III соответственно. Промоторы эукариот устроены более сложно, чем прокариотические, и состоят из нескольких элементов. Из низ самым близким к точке начала транскрипции является ТАТА-домен, называемый также доменом Хогнесса. Затем следуют домены ЦААТ и ГЦ. Промоторы эукариот могут содержать различные комбинации этих элементов, но ни один из них не встречается во всех промоторах. Домен ЦААТ играет существенную роль в инициации транскрипции, ТАТА и ГЦ, по-видимому, выполняют вспомогательные функции.

Связавшись с промотором, РНК-полимераза вызывает локальную денатурацию ДНК, т. е. разделение цепей ДНК на протяжении примерно 15 нуклеотидных пар. Образуется транскрипционный «глазок». Первым в строящуюся цепь РНК включается пуриновый нуклеотид – АТФ или ГТФ, при этом все три его фосфатных остатка сохраняются. После образования первой фосфодиэфирной связи σ-фактор у бактерий теряет связь с ферментом, и оставшийся core-фермент начинает перемещаться по ДНК. РНК-полимераза эукариот после инициации транскрипции также теряет связь с транскрипционными факторами и перемещается по ДНК самостоятельно.

2. Элонгация – последовательное удлинение растущей цепи РНК. Перемещаясь вдоль двойной спирали ДНК, РНК-полимераза непрерывно раскручивает спираль впереди того участка, где происходит синтез РНК. На короткое время образуется так называемый открытый комплекс, внутри которого возникает РНК-ДНК-спираль длиной около 20 нуклеотидов
(рис. 30). Затем фермент (с помощью специального сайта) вновь закручивает

Рис. 30. Элонгация транскрипции

ДНК позади участка полимеризации. РНК-транскрипт выводится из комплекса через особый канал, свойственный РНК-полимеразе.

Скорость синтеза РНК у бактерий составляет около 30 нуклеотидов в секунду, однако она не постоянна и может несколько снижаться. Такие периоды называют паузами транскрипции.

Показано, что еще до образования гибрида РНК-ДНК РНК-полимераза переводит ДНК из В-формы в А-форму. В ней плоскости азотистых оснований не перпендикулярны оси спирали, а наклонены на 20⁰ к перпендикуляру. Вероятно, это облегчает разъединение двух соседних азотистых оснований в цепи ДНК. Параметры РНК-ДНК-спирали также практически полностью идентичны характеристикам А-формы ДНК.

3. Терминация (окончание транскрипции) определяется особой нуклеотидной последовательностью ДНК, расположенной в зоне терминатора оперона. В бактериальных оперонах выделяют два типа терминаторов:

· ρ(ро)-независимые терминаторы (I типа);

· ρ-зависимые терминаторы (II типа).

ρ-независимые терминаторы состоят из последовательностей, представляющих собой инвертированный повтор – палиндром (рис. 31), и рас-

Рис. 31. ρ-независимая терминация транскрипции у бактерий

полагаются за 16-20 нуклеотидных пар от точки терминации. Палиндромы (последовательности, которые читаются одинаково слева направо и справа налево) ρ-независимых терминаторов содержат большое количество Г-Ц-повторов. За этим участком на матричной цепи расположена олиго(А)-последовательность (4-8 адениловых нуклеотидов подряд). Транскрипция в области палиндрома приводит к тому, что в получившемся РНК-транскрипте быстро образуется устойчивый элемент вторичной структуры – «шпилька» – спирализованная область, содержащая комплементарные
Г-Ц-пары. «Шпилька» нарушает прочность связи ДНК-РНК в открытом комплексе. Кроме этого транскрипция олиго(А)-последовательности в матричной цепи ведет к образованию участка ДНК-РНК-гибрида, составленного из непрочных А-У пар, что также способствует разрушению контакта между ДНК и РНК.

ρ-зависимые терминаторы. Одним из факторов транскрипции прокариот является белок ρ. ρ-фактор – это имеющий четвертичную структуру белок, обладающий АТФ-азной активностью. Он способен связываться с 5'-концом синтезируемой РНК длиной около 50 нуклеотидов. ρ-фактор движется по РНК с такой же скоростью, с которой РНК-полимераза движется по ДНК. Вследствие того что в терминаторе много Г-Ц-пар (с тремя водородными связями), РНК-полимераза в области терминатора замедляет ход, ρ-фактор ее догоняет, изменяет конформацию фермента, и синтез РНК прекращается (рис. 32).

На терминаторах обоих типов происходят три ключевых события:

· останавливается синтез РНК;

· цепь РНК освобождается от ДНК;

· РНК-полимераза освобождается от ДНК.

Процессинг РНК

Первичные РНК (предшественники РНК, гетерогенные ядерные РНК), образующиеся в результате транскрипции, в большинстве случаев представляют собой функционально неактивные молекулы. Поэтому сразу после транскрипции они претерпевают ряд модификаций и превращаются в зрелые РНК. Созревание первичных транскриптов называется процессингом.

Рис. 32. ρ-зависимая терминация транскрипции у бактерий

 

Для бактериальных клеток процессинг предшественников мРНК не характерен и необходим только при образовании зрелых молекул рРНК и тРНК.

Процессинг рнк у эукариот представляет собой достаточно сложный и тонко организованный процесс, непосредственно влияющий на регуляцию экспрессии генетического материала. Наиболее детально изучен процессинг мРНК эукариот, который включает:

· сплайсинг – вырезание из пре-мРНК некодирующих областей (интронов) и сшивание кодирующих структуру белка участков (экзонов);

· кэпирование – образование на 5′-конце мРНК особой структуры – кэпа – происходит вскоре после начала синтеза мРНК и осуществляется с участием ГТФ;

· полиаденилирование – образование на 3′-конце поли(А)-фрагмента, содержащего около 200 адениловых нуклеотидов (рис. 33).

 

Рис. 33. Процессинг мРНК

 

Механизм сплайсинга

В сплайсинге пре-мРНК эукариот принимает участие ряд белков, а также РНК особого вида – малые ядерные РНК (мяРНК). Различные мяРНК по принципу комплементарности связываются с пограничными участками интронов РНК. Для этого взаимодействия существенны определенные последовательности нуклеотидов в начале и конце интронов: так, интроны всегда начинаются с Г-У, а заканчиваются дуплетом А-Г. Малые ядерные РНК образуют комплекс с ферментами, катализирующими сплайсинг – сплайосому.

Первый разрыв пре-РНК происходит в области 5′-конца интрона, который связывается с одним из нуклеотидов в средней части того же интрона (рис. 34). Это приводит к образованию кольцевой (или, точнее, лассоподобной) структуры. Первая мяРНК диссоциирует, а ферментный комплекс перемещается к другой мяРНК, маркирующей 3′-конец интрона. Здесь происходит второй разрыв пре-РНК. Связь экзона 2 с интроном заменяется связью с экзоном 1.

 

Альтернативный сплайсинг

В ряде случаев возможно изменение хода сплайсинга и осуществление его по альтернативному варианту. В этом случае с одного гена считывается более одного типа мРНК. Альтернативный сплайсинг позволяет организму синтезировать разные по структуре и свойствам белки на базе одного гена. Такие гены кодируют семейства родственных белков, участвующих в мышечных сокращениях, формировании цитоскелета, нервных волокон, пептидных гормонов и др.

Рис. 34. Вероятный механизм спайсинга:

Е – ферментный комплекс (с нуклеазной и лигазной активностью)

 

Альтернативный сплайсинг мРНК включает три основных механизма:

1. Использование разных промоторов. При наличии в гене альтернативных промоторов разные типы РНК могут синтезироваться с разных сайтов инициации транскрипции. Альтернативный промотор – сложный промотор, состоящий по крайней мере из двух независимо функционирующих частей, расположенных перед разными экзонами одного гена. В этом случае образуются транскрипты, имеющие разные по длине 5′-концы и разное количество экзонов.

2. Изменение сайта полиаденилирования первичного транскрипта. В результате изменяются размеры и структура 3′-концевого участка пре-мРНК.

3. Соединение экзонов в различных комбинациях. При этом часть экзонов может не включаться в сплайсинг. Например, если ген содержит всего шесть экзонов (с 1-го по 6-й), в одном типе мРНК они могут располагаться в порядке 1,2,3,4,5,6, в других РНК порядок может быть иным, например 4,5,6,1,2,3, или 2,5,6, или 1,3,5.

Альтернативный сплайсинг обеспечивает тонкую регуляцию работы генов у эукариот, дифференцировку тканей, определяет развитие различных признаков, детерминированных одним геном. У человека около 1/3 всех генов может кодировать более одного белка, т. е. разные белки кодируются разными сочетаниями экзонов одного и того же гена. Наличие альтернативного сплайсинга может объяснить тот факт, что количество белков в организме человека в несколько раз больше, чем число белок-кодирующих генов.

 

Трансляция

Трансляция – процесс перевода генетической информации с последовательности нуклеотидов мРНК в последовательность аминокислот в молекуле полипептида. Трансляция осуществляется согласно правилам генетического кода, который имеет следующие особенности:

1. Код – триплетный, т. е. одну аминокислоту определяет три нуклеотида.

2. Код – однозначный (специфичный): каждый кодон обозначает только одну аминокислоту.

3. Код – непрерывный, т. е. отсутствуют сигналы, показывающие конец одного кодона и начало следующего.

4. Код – вырожденный, т. е. одной аминокислоте может соответствовать более одного кодона. Только две аминокислоты – метионин и триптофан – имеют по одному кодону. Лейцину и серину соответствует 6 кодонов, глицину и аланину – по 4 и т. д. Если аминокислота кодируется несколькими кодонами, то в большинстве случаев они различаются по третьей букве, т. е. по нуклеотиду на 3′-конце. Таким образом, специфичность каждого кодона определяется главным образом его первыми двумя нуклеотидами.

5. Код не перекрывается, т. е. один нуклеотид не может одновременно входить в два соседних триплета.

6. Генетический код содержит триплеты, обозначающие начало и окончание синтеза белка. АУГ – инициирующий кодон (кодирует метионин). УАА, УАГ, УГА – терминирующие кодоны, которые не кодируют ни одну из известных аминокислот и сигнализируют об окончании синтеза белка.

7. Генетический код универсален, т. е. одинаков у животных, растений, многих бактерий.