Приведите данные значений аспарагиновой кислоты в азотной регуляции биообъекта – продуцента лекарственных веществ

Аспарагиновая кислота синтезируется всеми формами микроорганизмов путем трансформирования щавелевой кислоты; входит в состав белков, бактерий, грибов, водорослей, а также служит основным сырьем для биосинтеза аспарагина.

Аспарагин из микроорганизмов синтезируется из аспарагиновой кислоты и аммиака за счет энергии АТФ при участии фермента аспарагинсинтетазы и в присутствии ионов магния:

+ АМФ + ФФн

+ АТФ ®

Бактерии используются в качестве донора NH₃ аминокислоты (аспарагиновую кислоту).

Известно, что конечными продуктами распада аминокислот являются вода, аммиак, углекислота. Аммиак, накапливающийся в процессе дезаминирования аминокислот, является токсичным соединением. Токсичность аммиака обусловлена тем, что он способствует восстановительному аминированию a-кетоглутаровой кислоты в митохондриях. При этом нарушается тканевое дыхание, идет избыточное накопление кетоновых тел из ацетил-КоА.,

У большинства растительных и животных видов аммиак переводится в безвредные для организма соединения: аспарагин, глутамин, мочевину.

У многих животных, в том числе у млекопитающих, образование мочевины служит основным путем обезвреживания и выведения аммиака.

Первичное связывание аммиака в клетке осуществляется в основном глутаминовой кислотой с образованием амида глутамата; процесс катализируется специфическим ферментом – глутаминсинтетазой и сопровождается распадом АТФ. По такой же схеме у многих организмов идет образование аспарагина.

Реакции образования аспарагина и глутамина широко представлены в растениях.

Таким образом, амидирование аспарагиновой и глутаминовой кислот может происходить и в том случае, если они находятся в связанном состоянии, например, в составе белковой молекулы, когда радикалы этих кислот свободны.

Следовательно, белки организма при наличии аспарагиновой кислоты могут быть акцептором аммиака, что обеспечивает немедленное связывание аммиака в любой точке, где он возникает в процессе обмена веществ.

Аспарагиновая кислота имеет важное значение в орнитиновом цикле. Орнитиновый цикл – основной путь обезвреживания аммиака осуществляется с образованием мочевины под действием различных ферментов с участием АТФ.

К билету №6

В промышленности микробного синтеза для питательных сред широко используются чистые углеводы, а также природные и технические продукты, богатые углеводами. К ним относятся глюкоза, сахароза, лактоза, крахмал, ку­курузная мука, меласса, зеленая патока.

Кукурузную муку получают при размалывании зерен кукурузы. В промышленных средах кукурузная мука часто заменяет крахмал, явля­ясь более дешевым сырьем.

Меласса - отход сахарного производства. Она представляет собой маточный раствор, образующийся при отделении кристаллов сахарозы на центрифуге после третьей кристаллизации. По внешнему виду ме­ласса - густая вязкая жидкость темно-коричневого цвета. Состав непо­стоянен и может колебаться в зависимости от почвенных и климатиче­ских условий выращивания свеклы, технологии ее переработки, усло­вий транспортировки и хранении мелассы.

Зеленая патока - отход производства глюкозы из крахмала. Она содержит не менее 76% редуцирующих веществ, золы - не более 3,5%, сухих веществ – не менее 50%. Сахара зеленой патоки состоят в основ­ном из глюкозы. Основная часть зольных элементов - хлористый на­трий, образующийся при нейтрализации соляной кислоты, применяе­мой для гидролиза крахмала содой.

Азотное питание микроорганизмов по своему значению прибли­жается к углеродному, хотя уступает последнему по объему. Азот вхо­дит в состав клеточных компонентов, которые обеспечивают жизне­способность организмов. Источниками азотного питания для проду­центов БАВ служат различные азотсодержащие вещества неорганиче­ского и органического происхождения. Источниками минерального азота чаще всего являются соли аммония и азотной кислоты. В качест­ве органических источников азота в промышленности наиболее широ­ко применяются кукурузный экстракт и соевая мука.

Кукурузный экстракт - это отход производства крахмала из ку­курузы. По внешнему виду это густая жидкость темно-коричневого цвета с хлопьевидной взвесью или почти однородная.

Соевую муку получают при размалывании соевых бобов, а также соевого жмыха и шрота, образующихся после извлечения соевого масла. Соевая мука подразделяется на необезжиренную, полуобезжиренную и обезжиренную.

Питательные среды по своему составу подразделяются на две группы: натуральные (естественные) и синтетические.

Натуральными называются среды, имеющие неопределенный химический состав, так как в них входят продукта растительного или животного происхождения, отходы различных производств. На нату­ральных средах хорошо развиваются многие микроорганизмы, так как в этих средах имеются, как правило, все компоненты, необходимые для их роста и развития.

Синтетическими называются среды, в состав которых входят только определенные химически чистые соединения, взятые в точно указанных концентрациях. Такие среды широко используются для ис­следований, связанных с изучением обмена веществ микроорганизмов.

По физическому состоянию среды подразделяются на жидкие, плотные и сыпучие.

Жидкие среды используются для накопления биомассы или про­дуктов метаболизма. Плотные среды готовят из жидких, добавляя агар-агар или кремнекислый гель (селикагель). Агар-агар удобен тем, что большинство микроорганизмов не может использовать его в качестве субстрата и поэтому он является лишь уплотняющим средством. В холодной воде полисахарид нерастворим, но растворяется в ней при нагревании до высокой температуры (90-100° С). При охлаждении агаровая среда застывает в виде студня с гладкой поверхностью. Такие среды используются для выделения чистых культур, для хранения культур, количественного учета микроорганизмов и в ряде других случаев.

Сыпучие среды - разваренное пшено, перловая крупа. Отруби, пропитанные питательным раствором, используют в промышленной микробиологии для получения некоторых БАВ, например, ферментов.

 

К билету №7

 

Рассматривая биотехнологию как современное направление в поиске новых лекарственных средств:

1. Приведите данные о механизме действия тубазида и фтивазида. Объясните, при скрининге каких лекарственных веществ они используются в качестве позитивного контроля.

 

Тубазид (изониазид) является гидразидом изоникотиновой кислоты, а фтивазид – производным гидразида изоникотиновой кислоты. Фармакологический эффект (противотуберкулезный) этих препаратов обеспечивает гидразид. Механизм действия тубазида и фтивазида состоит в том, что гидразид блокирует синтез миколиновой кислоты (обеспечивает кислоустойчивость микобактерий туберкулеза), препятствуя построению клеточной стенки микобактерий. В результате этого происходит лизис бактериальной клетки. Кроме этого, препарат нарушает синтез фосфолипидов, образует интра- и экстрацеллюлярные хелатные комплексы с двухвалентными ионами, тормозя окислительные процессы и синтез ДНК и РНК.

Тубозид и фтивазид используются при скрининге и изучении фармакологического эффекта препаратов, которые в результате метаболизма подвергаются ацетилированию. С их помощью устанавливают к какому типу (по метаболизму) относятся отдельные люди.

Впервые Haris (1958) и Evans с соавт. (1960) показали, что у людей скорость метаболизма противотуберкулезных препаратов (тубозид, фтивазид) распределяется бимодально. Это приводит к бимодальному распределению величины константы элиминации и соответственно величины t_1/2 изониазида. Причина этого явления заключается в различной активности у разных людей N-ацетилтрансферазы – фермента, ацетилирующего ряд лекарственных препаратов, в том числе и изониазид. У части людей ацетилирование протекает медленно. Такие ацетилляторы называют медленными ацетилляторами, а у других – быстрых ацетилляторов – в несколько раз быстрее. Позже было обнаружено, что аналогичные явления (полиморфизм ацетилирования) наблюдается и для ряда других препаратов, молекула которых трансформируется в организме путем присоединения по атому азота ацетильной группы:

К препаратам с бимодальным распределением скорости ацетилирования, кроме изониазида, относятся многие сульфаниламиды (но не сульфаниламид – белый стрептоцид – для него распределение унимодально), новокаинамид, гидролазин (апрессин), амритон, дапсон, D-пенициллин, фенелзин; ацетилируются также некоторые метаболиты лекарств, у которых аминогруппа появляется в результате биотрансформации в организме, например, после ферментативного восстановления нитрогруппы в молекуле нитразепама или после окислительного диметилирования амидопирина.

Соотношение медленных и быстрых ацетиляторов значительно меняется в зависимости от этнической группы. Однако не наблюдается различий в соотношении фенотипов у мужчин и женщин, не меняется это соотношение и в старческом возрасте.

Еще Evans и соавт. (1960) показали, что этот феномен определяется генетическими факторами, а именно активность фермента N-ацетилтрансферазы контролируется двумя аллелями одного локуса. Наследование медленного ацетилирования осуществляется по аутосомальнорецессивному механизму.

Различие в фенотипических группах медленных и быстрых ацетилляторов (с точки зрения фармакокинетики и эффективности фармакотерапии для отдельных препаратов) приводят к тому, что при назначении препаратов внутрь без учета фенотипа:

1. у быстрых ацетиляторов лечение будет неэффективным;

2. у медленных ацетиляторов возникают побочные явления со стороны сердечно-сосудистой системы и происходит накопление препарата в организме.

К билету №8

В условиях биотехнологического производства лекарственных препаратов:

1. Определите как органический синтез может сочетаться с методами генетики.

2. Опишите получение блок-мутантов и возможности мутагенеза.

 

1. Органический синтез может сочетаться с методами генетики по следующим направлениям:

1. Использование мутасинтеза для получения новых антибиотиков. Мутасинтез основан на использовании мутантных штаммов микроорганизмов, у которых блокирован синтез отдельных ферментов антибиотиков. В среду культивирования вносят аналоги этих ферментов, которые микроорганизм использует для биосинтеза. В результате получают модифицированный антибиотик.

2. Получение полусинтетических антибиотиков. Например, сначала с помощью микроорганизмов получают окситетрациклин, а затем, путем чисто химической модификации, из него получают рондомицин и доксициклин.

3. Использование биоконверсии: превращение метаболитов в структурно-родственные соединения под действием микробных клеток. Например, так получают кортизон: сначала синтезируют прогестерон, а затем микробы превращают его в кортизон.

 

2. За последние годы уже не удается обнаруживать новые антибиотики среди продуктов жизнедеятельности микроорганизмов. Поэтому ученые всего мира изучают пути направленного биосинтеза антибиотиков. Под направленным биосинтезом понимают целенаправленное вмешательство в метаболизм организма-продуцента для получения новых веществ. Важнейшую роль в этом играет селекция микроорганизмов. Селекция может происходить естественным или искусственным путем в результате мутации. Мутации могут возникать в результате либо воздействия физических или химических факторов, либо ошибок в процессе репликации и рекомбинации ДНК. Одним из наиболее важных физических мутагенов является ионизирующая радиация. Она приводит к образованию в клетке свободных радикалов (молекул с неспаренными электронами), которые исключительно реакционноспособны и могут повредить ДНК. Коротковолновый ультрафиолетовый свет (УФ) также оказывает мутагенное действие. Наиболее распространенным химическим изменением, вызванным УФ облучением, является образование тиминовых димеров, когда два соседних тиминовых основания ковалентно связываются друг с другом, Это приводит к ошибкам при считывании ДНК во время репликации и транскрипции. Из множества химических мутагенов чаще всего используются описанные ниже.

Азотистая кислота и гидроксиламин дезаминируют азотистые основания, т.е.превращают цитозин в урацил, а аденин в гуанин. Алкилирующие соединения имеют реакционные группы, которые могут образовывать ковалентные связи с азотистыми основаниями, входящими в ДНК. Метилнитрозамины распадаются с образованием реакционно способного метилкатиона, который метилирует группы –ОН– и –NH₂– в ДНК. Ароматический углеводород бензпирен сам по себе безвреден, но в результате метаболической трансформации образует производные, обладающие канцерогенными свойствами. За счет гидроксилирования одного из колец он превращается в реакционноспособный эпоксид, который алкилирует аминогруппу гуанина и других азотистых оснований. Токсичен и свободный радикал бензпирена.

Азотистая кислота вызывает точечные мутации. Мутации типа вставки или выпадение некоторого числа нуклеотидов не кратного трем, ведут к ошибочной трансляции всей ДНК, поскольку они сдвигают рамку считывания. При трансляции измененная мРНК будет интерпретироваться рибосомами по другому, приводя к совершенно иной аминокислотной последовательности. При получении мутантов микроорганизмов чаще всего используют сразу несколько методов.

Блок-мутанты – микроорганизмы, у которых блокирован синтез отдельных фрагментов антибиотиков.

После обработки микроорганизмов мутагенами отобранные мутанты высевают на питательный агар, получают по 50 колоний и проверяют способность микробов к образованию антибиотиков.

Возможности мутагенеза состоят в том, что комбинации мутантов-продуцентов антибиотических веществ и предшественников используются для направленного биосинтеза антибиотиков с измененными свойствами.

Так, в лаборатории Готтлиба в США еще в 1969 г. получен мутант Act fradiae – продуцент неомицина, который способен синтезировать молекулу антибиотика, за исключением ее 2-деоксистрептаминовой части. Образование неомицина этим мутагеном отмечается только в том случае, если в среду для его развития добавлен 2-дезоксистрептамин. При замене этого соединения его аналогами удалось получить новые биологически активные неомицины (Shier, Renehart, and Gottliob, 1969). Такой же метод был использован и для получения аналогов других антибиотиков (новоблоцина, капимицина и некоторых других).

К билету №9

Наибольший интерес для среди представителей царства животных для биотехнололгии имеют хордовые (Chordata). Их подразделяют на два подтипа – бесчерепные (Protochordata, seu Acrania) и черепные, или позвоночные (Craniata, seu Vertebrata). Всех черепных объединяют в следующие классы: Cyclostomata (круглоротые), Pisces (рыбы), Amphibia (земноводные), Reptilia (пресмыкающиеся), Aves (птицы) и Mammalia (млекопитающие).

Хорошо известно, что человек является как донором, так объектом для иммунизации. Так, для производства гомологичной иммунной плазмы (антистафилококковой, противосинегнойной), противокоревого гамма-глобулина (донорского и плацентарного), альбумина, плазмы, эритроцетарной и лейкоцитарной масс для трансфузий в роли биообъекта выступает человек – донор того или иного полупродукта. В случае производства иммунной плазмы человек выступает, кроме того в качестве объекта иммунизации. В настоящее время в промышленном масштабе освоено выращивание лимфобластов человека, продуцирующих интерферон.

Крупные животные лошадь, осел, мул являются объектами для иммунизации и одновременно продуцентами гетерологических антитоксических сывороток (противодифтерийной, противостолбнячной, противоботулинической, анти-эфа, анти-гюрза и др.). Кроме того, они являются донорами сыворотки и эритроцитов для производства холинэстеразы (для диагностики).

Корова и як являются донаторами поджелудочной, паращитовидной желез, гипофиза, семенников, хрящей для производства препаратов из животного сырья: инсулина, панкреатина, паратиреоидина, тиреотропина, гиалуронидазы и румалона соответственно.

Свинья являются донатором слизистой желудка для производства пепсина и поджелудочной железы – для производства инсулина. Марал (изюбр, пятнистый олень) является донором пантов, из которых получают пантокрин.

Варан выступает в качестве донора нормальных эритроцитов для постановки реакции связывания комплемента (РСК), а также в качестве объекта иммунизации и продуцента различных диагностических сывороток. Коза в этой же роли выступает для получения гетерологической антисыворотки к вирусу клещевого энцефалита.

В качестве доноров используются морская свинка – для получения комплемента для постановки РСК и кролик – для изготовления диагностических сывороток. Новорожденные крольчата являются объектом для размножения вируса при производстве вакцины против бешенства.

Из класса птиц в биотехнологии нашла применение курица в роли донора яиц: их белковая фракция используется для производства лизоцима , фракция желтка – для получения лецитина. Куриный эмбрион используют как объект для размножения вируса при получении вакцины против гриппа.

Из типа хордовых, класса рептилий нашли применение змеи в качестве донора антигенов для иммунизации продуцентов при производстве антитоксических сывороток анти-эфа, анти-гюрза и др.

Пчелы, являющиеся представителями типа членистоногих, класса насекомых, выступают донаторами тканей брюшных желез при получении пчелиного яда, донаторами тканей для производства маточного молочка, головные железы пчел используют для изготовления апилактозы.

Тип членистоногих, класс паукообразных в качестве биообъекта имеет скорпиона, используемого в качестве донатора яда – антигена для иммунизации продуцентов при производстве антитоксической сыворотки.

Для получения различных вакцин в качестве объектов для размножения вирусов используют органы и ткани, в том числе, эмбриональные различных животных: почки обезьян (вакцины против полиомиелита), почки морских свинок и фибробласты японских перепелок (противокоревая живая сухая вакцина), фибробласты куриного эмбриона (вакцина против клещевого энцефалита), мозговая ткань целостных организмов кроликов, крыс, овец (антирабические вакцины – для профилактики бешенства).

Перевиваемые опухоли животных, в частности, асцитные, нашли широкое применение в биотехнологии. Они хорошо растут в форме суспензии изолированных клеток в эксудате брюшной полости, например, крыс и мышей. Опухолевые клетки отсасывают из брюшной полости с помощью шприца и используют при производстве моноклональных антител и при изучении противоопухолевых химиотерапевтических веществ.

Необходимо отметить, что термином «донор»в данном случае обозначен биообъект, поставляющий материал для процесса производства лекарственного средства без ущерба для собственной жизнедеятельности, а термином «донатор» – биообъект, у которого забор материала для производства лекарственного средства оказывается несовместимым с продолжением жизнедеятельности.

К билету №10

 

Используя биотехнологию как производственную сферу:

1. Обоснуйте возможность лучевой стерилизации раствора Рингера в ампулах.

2. Обоснуйте возможность визуальной проверки ранее проведенного этого вида стерилизации лекарственных препаратов во флаконах и ампулах.

 

Лучистая энергия избирательно действует на клетки живого организма, в т.ч. и на различные микроорганизмы. Принципы стерилизующего эффекта этих излучений основана на способности вызывать, в живых клетках при определенных дозах поглощенной энергии такие изменения, которые неизбежно приводят их к гибели за счет нарушения метаболических процессов и коагуляции белка.

Источником ионизирующих γ-излучений служат долгоживущие изотопы ⁶⁰Со₂₇, ¹³⁷Cs₅₅, ускорители электронов прямого действия и линейные ускорители электронов. Для бактерицидного эффекта достаточно от 15 до 25 кГр, причем верхний предел необходим для инактивации споровых форм.

В настоящее время накоплен большой опыт применения этого метода, точно установлены типичные дозы излучения, необходимые для надежной стерилизации, разработано радиационное оборудование для высокопроизводительного процесса стерилизации, решены вопросы безопасности работы установок для обслуживающего персонала. Этот метод по экономическим показателям превосходит асептическое изготовление растворов со стерильной фильтрацией, но несколько уступает тепловой стерилизации. Однако в будущем может приблизиться к ней из-за неизбежного снижения относительной стоимости изотопов − побочных продуктов атомной энергетики.

Визуальная проверка ранее проведенного этого вида стерилизации лекарственных препаратов во флаконах и ампулах возможна благодаря тому, что при развитии микроорганизмов можно визуально наблюдать следующие проявления их жизнедеятельности:

· газообразование;

· пенообразование;

· помутнение раствора;

· образование пленки на поверхности раствора.

Эти явления можно наблюдать не сразу, а через несколько дней после некачественной стерилизации. Такой метод контроля стерилизации не достаточно надежен. В настоящее время стерильность растворов проверяют методом выборочного посева растворов (количество проверяемых флаконов зависит от количества флаконов в серии) на питательные среды.

 

К билету №11

Продемонстрируйте возможности биотехнологии;

1. Получение горицвета весеннего независимо от сезона.

 

Для получения горицвета весеннего независимо от сезона можно использовать метод культур тканей или микроразмножение in vitro. Преимущества такого метода:

- возможность круглогодичного выращивания растений или только их тканей независимо от климатических и географических факторов;

- освобождение земельных площадей;

- стандартность и более высокое качество сырья;

- возможность автоматизации технологических процессов, снижения доли ручного труда;

- освобождение от импорта лекарственного сырья.

Побеги высаживают в почву. Культуру побегов можно получить из меристематических тканей, способных сформировать побег. Методика получения культуры каллусной ткани заключается в следующем: вычленяют эксплант из меристематической ткани (размером 0,5-1,0 мм), стерелизуют его и помещают на питательную среду определенного состава. Через несколько дней на изолированном кусочке ткани растения образуется каллус – бесформенная масса ткани сероватого или желтоватого цвета. Образовавшийся каллус в асептических условиях отделяют и переносят на свежую питательную среду для дальнейшего роста. Полученную ткань можно поддерживать в культуре неограниченно длительное время, периодически расчленяя и пересаживая ее на свежую питательную среду. Рост пересаженных растений происходит в контролируемых условиях при температуре 24-28°С. Внешне такая ткань совершенно не похожа на растение, от которого она была получена, но ее клетки несут генетическую информацию, свойственную данному виду. Культивирование растительных тканей можно осуществлять на агаризованных питательных средах, имеющих плотную консистенцию. В присутствии фитогормонов (ауксины и цитокины) и в определенных условиях из каллуса формируются кончики побегов. Кончики или микрочеренки, культивируемые на питательных средах в условиях in vitro развивают побеги второго порядка, образуя в результате агрегат, состоящий из почек, побегов и иногда каллуса, и заполняя почти весь сосуд. Такую культуру побегов можно разделить на отдельные побеги. Перед высадкой проростков в грунт прибегают к стимуляции корнеобразования с помощью индолилмасляной кислоты (0,5-10 мг/л). Микроразмножение in vitro обеспечивает быстрое вегетативное размножение не только трав, но и древесных растений.

К вопросу №12

В условиях биотехнологического производства лекарственных средств:

1. Укажите важные для производства свойства биообъекта, которые могут быть практической целью его совершенствования.

 

Для реализации биотехнологических процессов важными свойствами биообъекта, которые могут быть практической целью его совершенствования, являются: чистота, скорость размножения клеток и репродукции вирусных частиц, активность и стабильность биомолекул или биосистем.

«Чистота» необходима для исключения возможности влияния на биообъекты других организмов (в виде их продуктов жизнедеятельности и т.д.). Чистоту достигают:

- проведением процессов в асептических условиях;

- путем стерилизации питательных сред, оборудования, фильтров для очистки воздуха, пеногасителей, различных жидких добавок и др.;

- использованием высококачественного материала;

- предупреждением загрязнения складских помещений готовой продукции;

- предупреждением заболеваний среди производственного персонала.

Скорость размножения клеток и репродукции вирусных частиц регулируют, создавая благоприятные условия культивирования (улучшая технологические условия культивирования): подбирают состав, рН, температуру, скорость перемешивания, вязкость среды, окислительно-восстановительные условия и другие факторы.

Активность биомолекул или биосистем «поддерживают путем поддержания в среде производства (в реакторе):

- концентрации питательных веществ (главные показатели – концентрация азота и глюкозы);

- степени организации (концентрации кислорода и углекислого газа);

- скорости перемешивания;

- оптимальной температуры;

- определенной концентрации биомолекул или биосистем;

- определенной концентрации метаболитов;

- стерилизации конечного продукта производства (в отдельных случаях).

К билету №13

1. Биотехнология растений основана на методах культуры тканей in vitro. Она основана на уникальном свойстве растительных клеток – тотипотентности.

Тотипотентность – это свойство соматических клеток растений полностью реализовывать свой потенциал развития обеспечивающий их дифференцировку и в дальнейшем образование целого организма. Другими словами любая живая растительная клетка потенциально способна развиваться в неорганизм, из которого была изолирована.

Выращивание изолированных клеток и тканей на искусственных питательных средах в стерильных условиях (in vitro) называется методом культуры изолированных тканей.

Хотя растительные клетки и ткани принадлежат к более дифференцированным организмам в сравнении, например, с бактериями, они способны культивироваться в форме неорганизованной клеточной массы – каллуса.

Каллус – это ткань, возникшая путём неорганизованной пролиферации клеток органов растения.

Фрагмент ткани или органа, инкубируемый самостоятельно или используемый для получения первичного каллуса называется эксплантом.

Возникновение каллуса связано с неорганизованным делением (пролиферацией) дефференцированных клеток. Дефференцировка – переход специализированных, неделящихся клеток к пролиферации. В процессе дифференцировки (специализации клтеок) клетки теряют способность делиться. Таким образом, дедифференцировка – возвращение клеток в меристематическое состояние, при котором они сохраняют способность к делению. Обязательное условие дедифференцировки тканей экспланта и превращения их в каллусные клетки – присутствие ауксинов и цитокининов. Ауксины вызывают процессы дедифференцировки клетки, подготавливают её к делению. Затем цитокинины инициируют деление клеток. Последние исследования свидетельствуют, что ауксины индуцируют синтез главной протеинкиназы клеточного деления Р₃₄^cdс2, а цитокинины – циклинов. Таким образом, действие этих гормонов проявляется только при последовательном или одновременном внесении их в среду.

 

2. Если культивирование происходит поверхностно на агаризованной питательной среде, то образуется каллусная ткань. Она не имеет четко выраженной структуры, но может различаться по плотности. Происхождение и условия выращивания определяют, будет ли каллусная ткань рыхлой, средней плотности или плотной. Рыхлая каллусная ткань имеет сильно обводненные клетки и легко распадается, может быть использована для получения суспензионной культуры.

Ткань средней плотности характеризуется хорошо выраженными меристематическими очагами. В ней легко индуцируются процессы органогенеза. Наконец, у плотных каллусных тканей различают зоны редуцированного камбия и трахеидоподобных элементов.

 

 

		КУЛЬТУРА

 

Существует также суспензионная культура клеток, которую выращивают в жидкой питательной среде, так называемое глубинное культивирование. Клеточные суспензии образуются как из каллусных тканей, так и непосредственно из экспланта. Можно сказать, что суспензионные культуры представлены агрегатами каллусных клеток.

В случае выращивания суспензионных культур необходимо иметь такие линии, которые отвечали бы следующим требованиям:

- склонность к размножению в дезагрегированном состоянии;

- морфологическая выравненность (круглая или овальная форма);

- удовлетворительная скорость размножения;

- сохранность путей метаболизма;

 

К билету №14

С точки зрения биотехнологических исследований:

1. Оцените роль L-D глюкопиранозы в энергетическом метаболизме.

2. Опишите механизм катаболитной репрессии биосинтеза вторичных метаболитов, вызываемой этим веществом.

 

L-D глюкопираноза (глюкоза) – важнейший природный полисахарид. Она является транспортной формой углеводов в крови позвоночных. Глюкоза поступает в клетки, где используется в качестве клеточного «топлива» (гликолиз) или превращается в другие метаболиты. В присутствии кислорода (в аэробных условиях) большинство клеток животных получают энергию за счет полного разрушения питательных веществ (липидов, аминокислот и углеводов), т.е. за счет окислительных процессов. В отсутствии кислорода (анаэробные условия) клетка может синтезировать АТФ (АТР) только за счет гликолитического разрушения глюкозы, хотя разрушение глюкозы, заканчивающееся образованием лактата, дает незначительную энергию для синтеза АТФ, этот процесс имеет решающее значение для существования клеток при недостатке или в отсутствии кислорода.

В аэробных условиях (на схеме слева) АТФ образуется почти исключительно за счет окислительного фосфорилирования. Глюкоза в цитоплазме превращается в пируват путем гликолиза. Пируват транспортируется в митохондриальный матрикс, где декарбоксилируется пируватдегидрогеназным комплексом с образованием ацетил-КоА. Восстановительные эквиваленты ([2НАДН⁺+Н⁺(NАДН+Н⁺) на молекулу глюкозы], высвобождающиеся при гликолизе, переносятся в матрикс митохондрий малатным челноком. В соответствии с энергетическими потребностями клетки восстановительные эквиваленты переносятся дыхательной цепью на кислород. При этом высвобождается химическая энергия, которая путем создания протонного градиента используется для синтеза АТФ. В отсутствие кислорода, т.е. в анаэробных условиях (на схеме справа) картина полностью меняется. Т.к. электронных акцепторов для электронной цепи не хватает, НАДН+Н⁺ и QН₂ не могут окисляться повторно. Вследствие этого останавливается не только митохондриальный синтез АТФ, но почти весь обмен веществ в митохондриальном матриксе. Главной причиной такой остановки является высокая концентрация НАДН (NАДН), ингибирующая цитратный цикл и пируватдегидрогеназу. Останавливаются также процессы b-окисления и функционирование малатного челнока, зависящие от наличия сводного НАД⁺. Поскольку энергия уже не может быть получена за счет деградации аминокислот, клетка становится полностью зависимой в энергетическом отношении от потребления глюкозы при гликолизе. При этом обязательным условием является постоянное окисление образующегося НАДН + Н⁺. Так как этот процесс уже не может идти в митохондриях в клетках животных, функционирующих в анаэробных условиях, пируват восстанавливается до лактата, который поступает в кровь. Процессы этого типа называют брожением. Продукция АТФ при этих процессах незначительна: при образовании лактата возникают только 2 молекулы АТФ на молекулу глюкозы.

Для того, чтобы оценить число образованных в аэробном состоянии молекул АТФ, необходимо знать так называемое р/о –соотношение, т.е. молярное соотношение синтезированных АТФ (р) и воды (о). Во время переноса двух электронов от НАДН на О₂ в межмембранное пространство транспортируются около 10 изотопов и только 6 молекул убихинона (QН₂). Для синтеза АТФ-синтаза передается в трех ионах Н⁺, так что максимально возможное р/о-соотношение составляет примерно 3 или, соответственно 2 (для убихинона). Нужно, однако учитывать, что при переходе метаболитов в матрикс и обмене митохондриального АТФ^4- на цитоплазматический АДФ^3- в межмембранном пространстве. Также расходуются протоны. Поэтому при окислении НАДН р/о-соотношение скорее всего составляет 2,5, а при окислении QН₂ – 1,5. Если на основе этих величин рассчитать энергобаланс аэробного гликолиза, получается что окисление глюкозы сопровождается синтезом 32 молекул АТФ.

Катаболизм – процессы деградации, диссимиляции. Сюда относятся различные реакции расщепления (гидролиз, фосфоролиз) и окисления. Крупные органические молекулы расщепляются до простых веществ с одновременным выделением содержащейся в них свободной химической энергии. Энергия запасается организмом в форме АТФ и в ряде других соединений, а затем используется на процессы жизнедеятельности.

Репрессия – снижение, подавление синтеза.

Катаболическая репрессия – подавление синтеза под воздействием метаболитом, в данном случае, образующихся при окислении глюкозы.

Метаболиты. Высокие концентрации АТФ (АТП) и цитрата тормозят гликолиз путем аллостерической фосфофруктокиназы. Кроме того, АТФ тормозит пируваткиназу. Ингибитором пируваткиназы является ацетил-КоА. Все эти метаболиты образуются при распаде глюкозы (торможение конечным продуктом). АМФ (АМП), сигнал дефицита АТФ, активирует расщепление гликогена и тормозит глюконеогенез

 

 

К билету №15

Используя исследования биотехнологического характера:

Приведите данные о механизме действия вещества сульфацила-натрия.

Сульфацил-натрия относится к сульфаниламидным препаратам. Это производные сульфаниламида который является структурным аналогом параминобензойной кислоты:

Сульфаниламиды отличаются от парааминобензойной кислоты лишь наличием – SO₂ – NH₂ – группы, заменивший в последней карбоксильную группу. При попадании в больной организм сульфацил-натрий конкурирует с парааминобензойной кислоты при включении в молекулу фолиевой кислоты. Это происходит по двум причинам. Во- первых, сульфаниламиды ингибируют ферменты, субстратом которых служит парааминобензойная кислота. Во-вторых эти ферменты вследствие недостаточной субстратной специфичности могут использовать в качестве субстрата (псевдосубстраты) сульфаниламиды. При этом синтезируется не фолиевая кислота, а ее аналог, содержащий сульфаниламидный компонент в