Торможение реакции транспептидирования

(b-лактамы)

Все пенициллины и цефалосперины (b-лактамные антибиотики) является селиктивными ингибиторами синтеза клеточной стенки. Первый этап действия препарата заключается в его связывание с клеточными рецепторами. Такими рецепторами являются пеницилиносвязывающие протеины (ПСП количеством от 3 до 6 (мол.М.К +- 40000-120000) у различных бактерий. Так, присоединение пенициллина к одному ПСП может вызывать, аномальное увеличение клетки, в то время как присоединение к другому может приводить к появлению дефекта на поверхности клеточной стенки. После связывания b-лактамного препарата с его рецепторами ингибируется реакция транспектидирования и останавливается синтез пептидогликана. Следующий этап, включает устранение или инактивацию ингибитора аутолитическими энзимами (гидролазами) в клеточной стенке. Это сопровождается активацией литического энзима и некоторых микроорганизмов, и может приводить к лизису клетки в условиях изотоничности окружающей среды.

Угнетение активности ферментов реакции транспептидирования пенициллина и цикалоспоринами может быть обусловлено подобием химического строения этих препаратов, со структурой ацил-0-алания – L – аланина. Реакция транспептидирования включает отцепление Д-аланина от пентапептида.

 

Угнетение синтеза предшественников пептидогликана

Некоторые препараты, включая бацитрацин, ванкомицин и ристацетин, тормозят ранние этапы биосинтеза пептидогликана.

Циклосерин, аналог Д-аланина, также влияет на синтез пептидегликана. Этот препарат блокирует действие рациназы аланина-фермента, обеспечивающего включения Д-аланина в пентапептид аминогликана. Фосфотопептиды тормозят активность ферментов, необходимых на ранних этапах синтеза пептидогликанов.

Антимикробное действие посредством нарушения функции клеточной мембраны проявляют (амфотерицин В, азолы, полимиксины, полиены).

Цитоплазма всех живых клеток окружена цитоплазматической мембраной, которая является барьером избирательной проницаемости. Цитоплазматическая мембрана некоторых бактерий и грибов легче повреждается определенными химическими соединениями, чем мембраны некоторых клеток. Поэтому становится возможным избирательное химиотерапевтическое воздействие.

Примерами препаратов с таким механизмом являются полимиксины действующие на грамотрицательтные бактерии (полимиксины избирательно влияют на мембраны, богатые фосфатидилэтаноламином, и действуют как катионные детергенты) и полиеновые антибиотики действующие на грибы. При этом полимексины неактивны в отношении грибов, а полиены не действуют на бактерии. Это объясняется наличием эргостерола в клеточной мембране грибов и отсутствием его бактериальной клеточной мембраны. Для проявления действия полиенов необходим эргостерол в клеточной мембране грибов.

2.Сравните возможности антисептиков и антибиотиков.

Идеальное противомикробное средство должно обладать избирательной токсичностью. Этот термин подразумевает наличие из препарата повреждающих свойств в отношение возбудителя заболевания и отсутствие таковых в отношении организма человека. Избирательность токсического действия обычно связана с угнетением биохимических процессов, которые происходят в микроорганизме и являются существенными для него, но не для организма хозяина.

Антисептики принципиально отличаются от действующих системно химиотерапевтических препаратов, в частности антибиотиков, отсутствием избирательной токсичности. Большинство этих веществ токсично не только для микроорганизмов, но и для клеток хозяина. Поэтому они могут использоваться с целью уничтожения микробных популяций в окружающей среде, а также применяться местно, но не системно, для подавления возбудителей заболеваний человека.

3. Укажите, какова биологическая роль антибиотиков

для их продуцентов.

Биологическая роль антибиотиков неоднозначна. В одном случае образование антибиотиков следует рассматривать как специфическую особенность обмена веществ организмов, возникшую и закрепленную у них в процессе эволюционного развития.

Биосинтез антибиотиков – наследственная особенность организмов проявляющаяся в том, что каждый вид (штамм) способен образовывать один или несколько вполне определенных, строго специфичных дня него антибиотических веществ.

Вместе с тем известно, что одинаковые антибиотики могут образовываться несколькими видами организмов

Вторая точка зрения состоит в том, что антибиотические вещества, образуемые микроорганизмами, носят случайный характер, зависящий лишь от условий культивирования. Образование антибиотиков - это незакрепленное свойство организма, проявляющийся только при развитии организма в специфической среде и при наличии особых внешних условий. Поэтому антибиотики не имеют для продуцентов приспособительного значения, их образование не связано с эволюцией микроорганизмов. Эта точка зрения основывается на двух положениях.

1. Не все микроорганизмы образуют антибиотические вещества, что, однако, не мешает их широкому распространению в природе.

2. Антибиотические вещества, даже самые устойчивые, довольно быстро инактивируются в почве, в этом естественном местообитании большинства микроорганизмов. Только при максимальном насыщении почвы антибиотиками можно получить соответствующий биологический эффект.

Как пишут Ваксман и Лешевалье (1962), антибиотики являются «лабораторными продуктами, образуемыми растущими чистыми культурами микроорганизмов в условиях богатой питательными веществами среды при хорошей аэрации, но они не обнаруживаются в почве.

Эксперементатору удается путем изменения условий культивирования получить больший или меньший выход антибиотика или создать условия, при которых антибиотик не будет вообще образовываться. Можно также путем изменения условий культивирования продуцента добиться преимущественного биосинтеза одного из антибиотиков, при условии образования изучаемым организмом нескольких антибиотических веществ, или же получить новые формы антибиотиков, не только в пределах тех соединений, которые способны снизить синтезироваться этим организмом. Наследственная способность продуцента стрептомицина состоит в том, что он может образовать стрептомицин или гризеин или другие антибиотики свойственное данному виду.

Образование антибиотиков – лишь одна из форм антагонистических взаимоотношений, существующих в мире микроорганизмов. В борьбе за распространение в природе микроорганизмы «используют» не только фактор «антибиотикообразования» но и многие другие эволюционно закрепленные особенности, дающие им преимущество в острой конкурентной борьбе с другими видами.

Образование антибиотиков микроорганизмами при культивировании их в условиях лаборатории действительно, по мнению многих исследований, проявляется далеко не у всех организмов. Так, в ряде работ отличается, что всего лишь 40-70% штаммов актиномицетов обладают антибиотической активностью, а остальные штаммы являются неактивными.

Однако Егоров (1956) экспериментально показал, что при соответствующих условиях культивирования все так называемые неактивные штаммы актиномицетов способны в той или иной степени образовывать антибиотические вещества и в лабораторных условиях. Макаровская (1956) и Егоров с сотрудниками (1960) установили, что продукты жизнедеятельности ряда микроорганизмов способствуют проявлению антибиотических свойств у так называемых неактивных штаммов актиномицетов, они также вызывают усиление уже ранее определенных антагонистических свойств актиномицетов.

Наконец, сторонники второй концепции основываются на том, что антибиотические вещества в почве быстро инактивируются, а поэтому не могут играть какой-либо биологической роли.

Действительно, многие антибиотики, искусственно внесенные в почву, довольно быстро в ней исчезают. Известно также, что многие антибиотики при тех же условиях могут сохраняться в почве довольно длительное время (до нескольких недель). При рассмотрении вопроса о биологической роли антибиотиков, образуемых микроорганизмами в естественных местах обитания, в особенности в почве, следует иметь ввиду, что в почве микроорганизмы расселяются не диффузно, а живут отдельными очагами колониями (Красильников, 1936, 1951; Новогрудский, 1936, 1949).

Существенное значение приобретает факт адсорбции микроорганизмов и продуктов их жизнедеятельности; в том числе и антибиотиков на частицах почвы (Звягинцев, 1973). В естественных местах обитания (почва) микроорганизмов происходит своеобразная имммобилизация клеток и образующихся продуктов метаболизма (антибиотиков, ферментов, токсинов и др.), что играет огромную роль в проявлении биологической активности у микроорганизмов.

Красильниковым было показано, что в тех местах, где имеется больше органических остатков, обильнее развиваются микробы и образуемые ими очаги, имеют большие размеры. Обычно такое развитие микроорганизмов наблюдается в порах между твердыми частицами почвы или на частицах почвы. При развитии микробного очага, который может состоять из представителей одного или нескольких (не антагонистичных) видов, образуются продукты жизнедеятельности, в том числе и антибиотические вещества, которые диффундируя в соседние поры, могут играть там важную биологическую роль.

Приведенный выше фактический материал и, в первую очередь, результаты исследований советских авторов, выполненные в последние годы, с достоверностью показывают, что антибиотики могут образовываться и образуются при развитии микроорганизмов в естественных местах их обитания (почва) без внесения туда дополнительных питательных веществ.

Образовавшиеся в почве антибиотики в зависимости их химического строения способны сохраняться там определенное время и проявлять свое биологическое действие.

Положения, из которых исходят противники активной биологической роли антибиотиков, имеют серьезные возражения. Они не могут ни в какой степени поколебать единственно правильный взгляд об активной биологической роли антибиотиков, развиваемый советскими микробиологами и поддержанный рядом зарубежных исследователей, рассматривающих образование антибиотических веществ как средство приспособления, выработавшиеся в процессе эволюционного развития организмов.

Разумеется, биологическую роль антибиотиков подробно можно выяснить лишь при детальном изучении отдельных веществ. Установлено, например, что некоторые антибиотики оказываются довольно вредными продуктами жизнедеятельности для собственных продуцентов. Так, флавипин, образуемый грибом Aspergillus slanipes, подавляет развитие собственного продуцента в концентрации 1,25 мгк/мл, а антибиотик пиацианин играет активную роль в окислительно-восстановительном процессе бактерий, образующих это вещество.

Однако любое детальное изучение биологической роли того или иного антибиотика может подтвердить лишь вывод о том, что это вещество не может быть случайным продуктом обмена, а есть результат метаболизма, появившегося в результате эволюции продуцента.

К билету №18

Антибиотики теперь относят к веществам природного, полусинтетического и, реже, синтетического происхождения, которые в малых концентрациях ингибируют рост (размножение) каких-либо микроорганизмов. Продуцентами одних антибиотиков (например, бацитрацина, полимиксина и др.), являются бациллы, других – актиномицеты (например, актиномицинов, гентамицинов, канамицинов), третьих – нитчатые грибы (например, гризеофульвина, пенициллинов, цефалоспоринов), четвертых – неспорообразующие бактерии (на­пример, монобактамов).

Так как антибиотические вещества являются вторичными метаболитами, то биосинтез их сопряжен с переходом культуры продуцента в идиофазу. Следовательно, здесь целесообразно ли­митирование роста продуцента. Таким лимитирующим ингредиен­том (фактором) при биосинтезе пенициллина выступает глюкоза, тогда как при биосинтезе антибиотиков стрептомицетами – фос­фаты. Все это важно при "компановке" питательных сред, подкор­мке штамма - продуцента в процессе биосинтеза антибиотика.

Так называемая "всеядность" актиномицетов обеспечивает им способность расти и продуцировать антибиотики на средах, содер­жащих белки (соевая мука, рыбная мука, белок клейковины пше­ницы и пр.), крахмал. Тем не менее, применительно к каждому продуценту имеются свои особенности, обычно отмечаемые в регламентной документации.

Перед выделением антибиотика из культуральной жидкости необходимо отделить твердую, или плотную фазу от жидкой. В этих случаях используют фильтрацию. Качество твердой фазы заметно сказывается на эффективности фильтрации. Здесь можно отметить следующую закономерность – нативная бактериальная масса фильтруется хуже мицелиальной. С учетом того факта, что высшие актиномицеты способны формировать нитчатые структуры, то их отделение при фильтрации происходит несколько легче, чем других бактерий. Пути улучшения фильтрации: обработка культуральных жидкостей электролитами, тепловая коагуляция, добавление фильтру­ющих наполнителей, кислотная коагуляция и некоторые другие.

Трудности выделения антибиотиков обусловлены многокомпонентностью культуральных жидкостей и малой концентрацией в них целевых продуктов. Сухие вещества после отделения мицелия обычно составляют порядка 3–6%, из которых лишь 15–30% приходятся на антибиотик. Поэ­тому любую культуральную среду необходимо обрабатывать так, чтобы антибиотическое вещество переходило в ту фазу, из которой затем он будет наиболее полно выделен. В ряде случаев этого можно добиться подкислением (тетрациклины) или, напротив, подщелачиванием культуральной жидкости (новобиоцин), добавлением солей, щавелевой кислоты (эритромицин) и т. д., до или после коагуляции и осаждения белков из нативных растворов.

Если для выделения антибиотика применяют ионный обмен, то нативный раствор стремятся освободить от ионов-конкурентов (растворимые оксалаты – для удаления ионов кальция; натрия триполифосфат – для связывания ионов магния; желтая кровяная соль – для комплексования ионов железа).

Антибиотические вещества, накапливающиеся в клеточной биомассе в процессе ферментации микробов-продуцентов, выделяют другими методами, нежели антибиотики, содержащиеся в культуральной жидкости. В первом случае, как правило, необходима экстракция каким-либо растворителем из нативных или дезинтегрированных клеток (система "твердое тело-жидкость"). В настоящее время все большее распространение приобретают мембранные методы концентрирования и выделения различных веществ, хотя до сих пор в ряде производств БАВ (включая антибиотики, например, пенициллин) не удалось отказаться от традиционных способов выделения и очистки целевых продуктов (экстракция в системе "жидкость-жидкость", адсорбция на активированных углях, диализ).

 

 

К билету 19.

 

В условиях биотехнологического производства лекарственных средств антимикробного действия:

1. Приведите основные типы используемых приборов и оборудования.

2. Остановитесь на основных принципах регуляции ферментации.

3. Обоснуйте необходимость особых мер предосторожности при производстве бета-лактамов.

Для изучения условий образования антибиотиков и производства этих биологически активных веществ в промышленных масштабах применяются ферментеры - специальные герметически закрытые емкости, обеспечивающие глубинное выращивание продуцентов антибиотиков.

Ферментер – это довольно сложный аппарат, в котором создаются хорошие условия для глубинного развития продуцента и биосинтеза антибиотика. В этих целях ферментер снабжен приспособлениями для достаточной аэрации и перемешивания культуры, поддержания необходимой температуры, а также контрольно-измерительными приборами (рис. 59).

Аэрирование культуры происходит в результате подачи стерильного подогретого до необходимой температуры воздуха через специальные приспособления-барботеры, а также благодаря перемешиванию культуральной жидкости различного типа мешалками (пропеллерными турбинами и др.) и наличию отбойников.

Повышение аэрации культуры в ферментере может быть достигнуто в результат применения мешалок новой конструкции, такие мешалки во время работы засасывают воздух, который затем струями выталкивается вместе с культуральной жидкостью на поверхность среды. При этом происходит большее растворение воздуха, благодаря его лучшему диспергированию в среде.

Поддержание температуры, оптимальной для хорошего роста продуцента антибиотика и проявления им повышенной физиолого-биохимической активности, обеспечивается рубашкой ферментера или системой змеевиков. Змеевики используются также для подачи пара в процессе стерилизации или воды для охлаждения.

Наблюдение за основными процессами жизнедеятельности организма осуществляется контрольно-измерительной аппаратурой. Это позволяет поддерживать на заданном уровне температуры внутри ферментера, рН среды, количество пропускаемого воздуха, давление внутри ферментера и другие параметры.

Применяются установки, позволяющие автоматически определять содержание азота в среде по ходу развития организма. Ферментеры снабжены приспособлениями для переноса инокулята, внесения дополнительных питательных веществ, необходимых для лучшего развития культуры пеногасителя и устройством для взятия пробы.

В зависимости от характера проводимых работ используются различного типа ферментеры: лабораторные, полупроизводственные или производственные.

Лабораторные ферментеры изготовляются из стекла или нержавеющей стали и имеют, как правило, емкость не более 30 литров. Обычно стерилизацию таких ферментеров производят в автоклавах. Питательную среду, как правило, стерилизуют отдельно, а затем переносят в стерильный ферментер.

Полупроизводственные ферментеры имеют емкость 100 литров, выполнены из нержавеющей стали.

В промышленных условиях получение антибиотиков применяют ферментеры различной емкости – от 500 л до 50 и 100 м³.

Стерилизация полупроизводственных и производственных ферментеров, а также всех обслуживающих их коммуникаций осуществляется перегретым паром. Воздух, необхдимый для аэрации, стерилизуется путем фильтрации через специальные фильтры, заложенные стеклянной ватой или активированным древесным углем.

Использование волокнистых фильтров (типа стеклянной ваты) широко распространенный и экономически наиболее выгодный механический способ стерилизации воздуха, причем меньший диаметр имеют волокна материалов, тем лучше фильтрующая способность их.

Интересно, что проникновение в фильтр бактериальных клеток или спор, перемещающихся с воздушным потоком, зависит от скорости движения воздуха. Проникновение увеличивается с увеличением скорости воздуха и достигает максимума в границах 10-25 м/с (в зависимости от плотности упаковки фильтра); при дальнейшем увеличении скорости движения воздуха проникновение частиц падает.

Биосинтез антибиотиков, как и любых других вторичных метаболитов, возрастает в фазе замедленного роста клеточной популяции (колец трофофазы) и достигает максимума, в стационарной фазе (идиофазе). Считают, что в конце трофофазы изменяется энзиматический статус клеток, появляются индукторы вторичного метаболизма, освобождающие гены вторичного метаболизма из под влияния катаболитной депрессии. Поэтому любые механизмы, тормозящие клеточную пролиферацию и активный рост, стрессовые ситуации, активируют процесс образования антибиотиков.

Процесс культивирования идиолитов проходит две фазы (двухступенчатое культивирование). На первой фазе происходит накопление достаточного количества биомассы, которая выращивается на среде для роста микроорганизма. Эта фаза должна быть быстрой, а питательная среда дешевой. На второй фазе осуществляются запуск и активный синтез антибиотика. На этой фазе ферментацию ведут на продуктивной среде.

Образование антибиотиков регулируется условиями культивирования микроорганизмов. Поэтому оптимизация питательной среды является главным факторов в повышении выхода продукта.

Многие антибиотики берут свое начало от промежуточных соединений обмена первичных метаболитов, поэтому их биосинтез регулируется путем ретроингибирования. Так, биосинтез пенициллина культурой гриба Penicillium chrysodenum контролируется по принципу обратной связи a-лизином. Этот эффект объясняется тем, что биосинтез как пенициллина, так и лизина осуществляется через общий предшественник – a –аминоадипиновую кислоту (см. схему). Торможение лизином первого фермента биосинтеза – гомоцитратсинтазы – приводит к недостатку a-аминоадипиновой кислоты, что снижает выход антибиотика.

a-Кетоглутарат+Ацетил-КоА

Гомоцитрат-

синтаза

Гомоцитрат

Гомоизоцитрат

a-Аминоадипинат

 

Лизин Бензилпенициллин

 

Добавление в питательную среду a-аминоадипиновой кислоты предотвращает ингибирующий эффект лизина и активирует биосинтез пенициллина в отсутствие лизина. Кроме ретроингибирования биосинтез многих антибиотиков тормозится высокими концентрациями своих же антибиотиков. Следует отметить, что в процессе эволюции микроорганизмы выработали механизмы защиты от действия собственных антибиотиков. Эта проблема успешно решается в результате использования иммобилизованных ферментов.

Большинство антибиотиков получают при глубинной аэробной ферментации периодического действия в асептических условиях. Период ферментации длится 7-10 суток. В последние годы внедряются полунепрерывные и непрерывные процессы ферментации. Технология завершающих стадий процесса определяется природой антибиотика, характером производства и целями дальнейшего использования антибиотиков.

Процесс биосинтеза пенициллина необходимо проводить при самом тщательном соблюдении стерильности всех операций – загрязнение культур посторонней микрофлорой вызывает резкое снижение накопления антибиотика. Известно, что многие бактерии, обычно встречающиеся в воздухе (Bac. subtilis, Bac. mesentericus, Bac. megatherium, Bac. cereus, E. coli и др.), способны образовывать фермент пенициллиназу, расщепляющий пенициллин. Пенициллиназа инактивирует пенициллин вследствие разрыва b-лактамного кольца молекулы антибиотика. В этой связи указанный фермент иногда называют пенициллин-b-лактамозой. Особенно активными продуцентами пенициллиназы являются Bac. subtilis и Bac. cereus. Загрязнение культуры гриба одной из этих бактерий может привести к резкому падению количества антибиотика в культуральной жидкости.

Температурный оптимум действия пенициллиназы 37°С. Одним из активных продуцентов пенициллиназы оказалась туберкулезная палочка Mycob. tuberculosis. Возможно, именно с этим свойством связана нечувствительность туберкулезных палочек к пенициллину.

К билету №20

В целях организации качественного проведения доклинических испытаний лекарственных и других биологически активных веществ (пищевых добавок, агрохимикатов и др.) в промышленно развитых странах (Англия, Германия, США, Фран­ция, Япония и др.) утверждены единые правила системы GLP (Good Laboratory Practice). Существует группа GLP в Европейском Центре по экологии и токсикологии химической промышленности; в США система GLP действует с июня 1979 г.

GMP – это единая система требований по контролю качества лекарственных средств с начала переработки сырья до производства готовых препаратов, включая общие требования к помещениям, оборудованию и персоналу. С 1975 г. правила GMP расширены, и они касаются различных химических и биологических веществ в индивидуальном виде, ветеринарных препаратов, применяемых в животноводстве; исходных материалов для использования в дозированных формах, если они включены в законодательства стран-экспортеров и стран-импортеров; и, наконец, информации о безопасности и эффективности перечисленных веществ, материалов и препаратов.

Правила GMP включает три части:

1) "Управление качеством в промышленном производстве лекарственных средств: философия и основные составляющие";

2) "Практика качественного производства и контроль качества";

3) "Дополнительные и вспомогательные направления". Первая часть содержит 12 разделов, касающихся организации контроля за качеством производства, санитарии и гигиены, заключения контрактов, стандартных рабочих методик, оформления необходимой документации и др. Вторая часть содержит два раздела – производство и контроль качества. Применительно к производству лекарственных средств указано, что оно должно опираться на принцип четкого соблюдения методов ведения технологического процесса согласно нормативно-технической документации с целью получения продукта требуемого качества и в соответствии с разрешением на его изготовление и продажу. По возможности избегать любых отклонений от методик или инструкций. При наличии таких отклонений необходимо согласование, разрешение, утверждение и подпись назначен­ного ответственного лица, а при необходимости – привлечение службы отдела контроля качества.

Операции с различными продуктами не должны выполняться, одновременно и последовательно в одном и том же помещении пока не устранен риск перемешивания или перекрестного загрязнения. Доступ в производственные помещения должен быть ограничен лишь определенным кругом лиц, занятым в производстве. Избегать изготовления немедицинской продукции в зонах и на оборудовании, предназначенных для изготовления фармацевтической продукции. При работе с сухими материалами и продуктами необходимы меры предосторожности для предупреждения возникнове­ния, накопления и распространения пыли, что может привести к перекрестному загрязнению изготавливаемых продуктов или к их микробному загрязнению. Микробы могут попадать в воздух и на частицы пыли из обсемененных ими материалов и продуктов при изготовлении, с загрязненных оборудования и одежды, кожи работающих людей. Перекрестное загрязнение может быть предотвращено изготовлением каждого целевого продукта в раздельных зонах (пенициллины, живые вакцины и другие БАВ) или, по крайней мере, разделением изготовления их по времени; обеспечением соответствующих воздушных шлюзов; ношением защитной технологической одежды; использованием средств эффективной деконтаминации оборудования, стен, и пр.; использованием "закрытых систем" производства и т. д.

Необходимо проверять правильность и надежность сочленения трубопроводов и другое оборудование, используемое для транс­портировки продуктов (материалов) из одной зоны в другую. Вода, поступающая по трубам, должна соответствовать санитарно-микробиологическим нормативам. Операции по техническому обслуживанию или ремонту не должны сказываться на качестве продукции. Контроль качества продукции касается процесса забора проб, проведения исследований, документации и пр. Все исследования должны проводиться согласно утвержденным инструкциям для каждого материала или продукта. Забор проб осуществляют таким образом, чтобы не загрязнить их или не подвергнуть нежелательному воздействию, сказываю­щемуся на качестве продукта или, напротив, чтобы отбираемый материал не был токсичным (вредным) для здоровья оператора. Для каждой партии продукта до выпуска должна иметься лабораторная документация с подтверждением соответствия конечного продукта спецификациям. Из каждой партии целевого продукта оставляют пробы на хранение при рекомендуемых условиях сроком не менее года, превышающего срок годности. Пробы должны храниться в таком количестве, чтобы можно было при необходимости провести как минимум два повторных исследования.

Третья часть требований GMP включает разделы о стерильных фармацевтических продуктах и практике качественного производства основной массы лекарственных субстанций.

В 1991 г. правила GMP утверждены в нашей стране применительно к производству и контролю качества лекарственных средств. Эти правила соответствуют Международной Системе GMP и включают следующие разделы: введение, терминология, персонал, здания и помещения, оборудование, процесс производства, отдел технического контроля, аттестация и контроль производства; выделены требования к стерильным лекарственным средствам и описаны особенности их производства.

Соблюдение правил GMP обеспечивает выпуск качественных продуктов и гарантирует благополучие потребителей. В 1995 г. ВОЗ утверждена GPP (Good Pharmacy Practice) по предложе­нию Международной Фармацевтической Федерации (FIP).

 

 

К билету 21

Выделение и очистка целевых продуктов биотехнологических процессов.

Культуральная жидкость, образующаяся в процессе ферментации, представляет собой сложную многофазную систему: в водной фазе содер­жатся клетки-продуценты, продукты их жизнедеятельности, непотреблен­ные компоненты питательной среды и др. При этом учитывают место на­копления целевого продукта: внутриклеточно или внеклеточно. На рисунке приведена схема выделения целевого продукта при различных вариантах его содержания.

Первый вариант выделения целевого продукта самый простой. На этой схеме базируется производство биовита (добавка к корму скота), основанного на использовании продуцентов-антибиотика хлортетрациклина – стрептомицетов. Кальциевый комплекс хлортетрациклина осаждают из культуральной жидкости, при рН выше 7,0. Формирующийся при этом осадок увлекает с собой и клетки продуцента. Так в осадке вместе с био­массой оказываются внеклеточный антибиотик и внутриклеточный витамин В₁. Осадок фильтруют, сушат, измельчают, добавляют отруби в качестве носителя и фасуют.

Вторая схема применяется, если целевым продуктом является биомасса клеток, например, кормовые или пекарские дрожжи. В этом случае вначале необходимо провести их концентрирование. При этом широко используют флотацию, с помощью которой увеличивают концентрацию дрожжей в 4-6 раз. Кроме того, для концентрирования можно использовать центрифугирование.

В третьей схеме приведены методы извлечения целевых продуктов из клеток биомассы. Полиеновые антибиотики, например, экстрагируют органическими растворителями из нативных клеток, тогда как эндоферменты получают из разрушенных (дезинтегрированных) клеток.

Выделение большей части продуктов микробного синтеза из культуральной жидкости начинают при их содержании около 1,5%. Однако чтобы можно было эффективно выделять вещества из культуральной жидкости с помощью осаждения, кристаллизации, высушивания и др., культуральпые жидкости необходимо подготовить к этим процессам. Для этого проводят обработку культуральной жидкости для коагуляции коллоидных примесей, получения хорошо отфильтровываемых осадков. Применяют несколько видов коагуляции: неорганическими солевыми электролитами, органическими и неорганическими кислотами, термической обработкой и др. Эффективным методом коагуляции дисперсных систем является обработка их высокомолекулярными полиэлектролитами - флоккуляторами. Затем образовавшийся осадок отфильтровывают, а из нативного раствора выделяют целевой продукт, используя экстракцию , ионный обмен, осаждение, кристаллизацию и другие методы выделения и очистки индивидуальных веществ.

 

К билету № 22.

Биотехнология в настоящее время получает некоторые лекарственные препараты на основе живых культур микроорганизмов – симбионтов (нормофлоры, пробиотики).

1. Приведите примеры этих препаратов.

2. Опишите их свойства.

3. Приведите название микроорганизмов, служащих основой препаратов.

4. Укажите методы получения и особенности применения препаратов.

Пробиотики – это вещества микробного или немикробного происхождения, оказывающие при естественном способе введения благоприятные эффекты на физиологическое и биологические функции организма хозяина через оптимизацию его микроэкологического статуса. Это нарушение предполагает, что любые живые или убитые микроорганизмы, их структурные компоненты, метаболиты, а также вещества другого происхождения, оказывающие позитивные влияния на функционирование микрофлоры хозяина, способствующие лучшей адаптации последнего к окружающей среде в конкретной экологической нише могут рассматриваться как пробиотики.

В России, наряду с термином «пробиотики» широко используют в качестве его синонима термин «эубиотики». Чаще всего последним обозначают фармакопейные бактерийные препараты из живых микроорганизмов, предназначенные для коррекции микрофлоры хозяина (например бифидумбактерии, бификол, колибактерии, лактобактерин, «Каринэ»,ацилакт, ацитол и т.д.). Однако по своей сути эубиотики согласно современным представлениям, следует рассматривать как частную разновидность пробиотиков, зарубежные препараты «Нормофлоры», «Гастрофарм», «Виолактиль», «Лактинес».

Можно выделить следующие группы пробиотиков:

- препараты, содержание живые микроорганизмы (монокультуры и их комплексы);

- препараты, содержащие структурные компоненты микроорганизмов – представителей нормативной микрофлоры и их метаболиты;

- препараты микробного или иного происхождения, стимулирующие рост и активность микроорганизмов представителей нормальной микрофлоры;

- препараты, представляющие собой комплексы живых микроорганизмов, их структурных компонентов и метаболитов в различных сочетаниях, стимулирующих рост представителей нормальной микрофлоры;

- препараты на основе живых генноинженерных штаммов микроорганизмов, их структурных компонентов и метаболитов с заданными характеристиками;

- продукты функционального питания на основе живых микроорганизмов, их метаболитов, других соединений микробного, растительного или животного происхождения, способных поддерживать и вос танавливать здоровье через коррекцию микробной палочки организма хозяина.

Положительный эффект пробиотиков на основе живых микроорганизмов на организм хозяина осуществляется через нормализацию микробной экологии хозяина за счет:

1. ингибирования роста потенциально вредных микроорганизмов в результате продукции антимикробных субстанций; конкуренции с ними за рецепторы адгезии и питательные вещества; активные иммунно-компетентных клеток;

2. стимуляции роста представителей эндогенной флоры в результате продукции витаминов и других ростстимулирующих факторов; нормализации рН, еН-потенциала; титрализации токсинов;

3. изменение микробного метаболизма проявляющегося в повышение или снижение активности ферментов.

Пробиотики на основе компонентов микробных клеток или метаболитов реализуют свое положительное влияние на физиологические функции и биохимические реакции или непосредственно вмешиваясь в метаболическую активность клеток соответствующих органов и тканей, либо опосредованной через регуляцию функционирования биоклеток на слизистых микроорганизмах.

Эффективность пробиотиков зависит от многих факторов: их состава, состояния микробной экологии хозяина, возрастной, половой и видовой принадлежности последнего, условий его проживания и др.

Наиболее часто для изготовления пробиотиков используют следующие виды микроорганизмов:

Bacillus subtillis, Colibacterinum siccum, Lactobacterinum siccum, Bificolum siccum, Bifidum bacterium siccum, Enterococcus faecalis, Es