Порядок проведения реакции

1 Инактивирование нормальной и гипериммунной сыворотки прогрева­нием при 56 °С в течение 30 мин.

2 Приготовление разведений ингредиентов реакции. Питательной средой без сыворотки и антибиотиков разводят антиген и сыворотки, начиная с 1:5, 1:50, 1:500 и до получения разведения содержанием менее 1 ТЦД₅₀/0,2 мл. Гипериммунную сыворотку разводят 1 : 2 или 1 : 5. При малом титре сыворотку используют неразведенной. Нормальную сыворотку разводят так же, как и гипериммунную.

3 Постановка реакции. В штативе размещают три ряда стерильных пробирок.

В первый ряд разливают разведенную гипериммунную сыворотку, во вто­рой – разведенную нормальную сыворотку, в третий – питательную среду. Каждый ингредиент вносят в объеме 0,5 мл.

Приготовленные разведения вируса переносят по 0,5 мл в соответствую­щие пробирки каждого из трех рядов, причем вирус каждого разведения переносят отдельной пипеткой, начиная с наибольшего разведения. Таким образом, в каждом ряду пробирок получают последовательные 10-кратные разведения вируса: 10^-1, 10^-2 и т.д.

Для контроля токсичности сывороток в отдельную пробирку вносят 0,5 мл приготовленного разведения гипериммунной сыворотки, а затем при­бавляют равное количество питательной среды. То же проделывают с нор­мальной сывороткой.

Пробирки со смесями тщательно встряхивают и выдерживают при ком­натной температуре в течение 1 часа. Затем заражают культуру клеток каждым разведением вируса (0,2 мл на каждую пробирку) с гипериммун­ной нормальной сыворотками и питательной средой по 4 пробирки культуры клеток. Параллельно ставят контроли на токсичность используемых клеток и контрольные пробы культуры клеток.

Пробирки с культурой клеток инкубируют в термостате при оптималь­ной для размножения данного вируса температуре, ежедневно просматри­вают под малым увеличением микроскопа для обнаружения ЦПД вируса. Результаты заносят в таблицу.

Титр вируса выражается количеством инфекционных единиц, содержа­щихся в единице объема суспензии вируса. Находят индекс нейтрализации (IN). Он соответствует максимальному количеству ИД₅₀, которое может быть нейтрализовано гипериммунной сывороткой. Расчет IN ведут по фор­муле: lgIN = lgT¹ –lgT₂, где Т¹ — титр вируса в присутствии нормальной сыворотки; Т₂ — титр вируса в присутствии гипериммунной сыворотки. Зна­чение IN находят по таблице антилогарифмов. Принято считать значение IN до 10 отрицательным, от 10 до 49 – сомнительным, 50 и более – поло­жительным результатом.

Результаты реакции можно считать достоверными только в том случае, если гипериммунная сыворотка проверена на специфическую нейтрализую­щую активность. Для этого предварительно определяют титр нейтрализую­щих антител в этой сыворотке или ее индекс нейтрализации в реакции с гомо­логичным вирусом.

Выделение рабдовирусов методом бляшек. Данный метод специфический, применяют его для выделения, предварительного типирования и селекции рабдовирусов карпа, форели при наличии специфических иммунных сыворо­ток для идентификации вируса.

Округлые колонии (бляшки) образуются в клеточных культурах под агаровым покрытием при наличии вируса в исследуемом материале.

В асептических условиях пастеровской пипеткой набирают ткань почек, печени, селезенки и жидкость из брюшной полости, переносят во флакон со средой, содержащей по 500 ME (мкг)/мл антибиотиков в соотношении 1 : 10, выдерживают 60-90 мин при температуре 18-22 °С, затем центрифугируют при 2-3 тыс. об/мин в течение 10 мин. Надосадочную жидкость разводят питательной средой 1 : 10 (разведение 1 : 100). Для заражения клеточных культур используют надосадочные жидкости обоих разведений.

Для исследования отбирают 3-суточную перевиваемую культуру клеток, выращенную в матрацах с хорошо выраженным монослоем, из расчета 2 мат­раца на каждое разведение патологического материала и по 2 матраца для контроля. Из флаконов удаляют питательную среду и вносят по 2 мл среды без эмбриональной сыворотки. Затем вносят по 0,2 мл исследуемого патматериала и оставляют для адсорбции вируса на 60 мин при температуре оптимальной для вирусов, поражающих рыб (для вирусов карпа – 24-26 °С и для вирусов форели – 16-18 °С).

Контроль ставят в 2 матрацах с клеточными культурами по 0,2 мл, содержащих по 100 ТЦД₅₀/мл известного вируса, а в 2 – по 0,2 мл пита­тельной среды без вируса.

Через 60 мин жидкость из флаконов удаляют. По стенке, противополож­ной монослою, вносят во флакон емкостью 50 мл 5 мл агарового покрытия, нагретого до 40-42 °С (при выделении вируса ВГС – не более 38 °С). Матрацы поворачивают монослоем вниз, покрывают черной бумагой. Через 15-20 мин матрацы переносят для инкубации при оптимальной для изучае­мых вирусов температуре. Матрацы кладут агаровым покрытием вверх. При неизвестном вирусе культуры содержат при двух температурных режимах – 14-18 и 22-24 °С.

Зараженные клеточные культуры просматривают на белом фоне. При наличии в изучаемом материале вируса в клеточной культуре вначале появ­ляются прозрачные точки на розово-матовом фоне культуры. В дальнейшем они увеличиваются в размере, образуя круглые прозрачные колонии – бляш­ки, наличие которых свидетельствует о наличии в патматериале рабдовирусов.

Пастеровской пипеткой набирают кусочек бляшки на границе поражен­ной и непораженной части с таким расчетом, чтобы попал не только агаро­вый, но и клеточный слой. Отобранный кусочек помещают в пробирку с 1 мл ростовой среды, замораживают при минус 20 °С и выдерживают 60 мин. В случае большого количества бляшек (весь клеточный слой прозрачный) исследования повторяют в разведениях 10-³ и 10-⁴.

Бляшки диаметром 3-8 мм рабдовируса карпа на перевиваемой куль­туре ЕРС и FHM, инкубируемой при температуре 24-26 °С, проявляются на 4-7-й день.

При отсутствии бляшек и наличии ЦПД в клеточных культурах прово­дят дополнительные исследования вируссодержащей культуральной жидкости в разведениях 10^-2-10^-3 (2-3 пассажа). В качестве дополнительных мето­дов идентификации вирусов используют: метод флуоресцирующих антител; определение чувствительности вируса к хлороформу, эфиру, величине рН, нагреванию; электронно-микроскопическое исследование морфологии вирусов.

Окончательным доказательством этиологической роли выделенного ви­руса является положительная биопроба.

Контрольные вопросы.

Что такое тропизм вируса?

1 Почему нельзя брать патологический материал от давно погибшей рыбы?

2 В какой период заболевания вероятность выделения вируса наибольшая и почему?

3 Как осуществляется сбор патологического материала и что при этом необходимо учитывать?

4 Каким образом экстрагируют вирус?

5 Какие методы и средства используют для деконтаминации патологиче­ского материала от бактериальной микрофлоры?

6 Почему обработанный патологический материал предпочтительно сразу использовать для исследований?

7 Как хранят обработанный патологический материал?

8 Чем определяется чувствительность культуры клеток к вирусу?

9 Что такое цитопатогенное действие (ЦПД) вируса и как оно проявля­ется?

10 Как оценивается ЦПД?

11 Какие культуры клеток используют для выделения вируса?

12 Что означает понятие «слепые пассажи» и для чего они проводятся?

13 С какой целью прогревают сыворотку, используемую для приготовления питательной среды?

14 Что такое пассирование вируса на культуре клеток?

15 Из каких этапов складывается проведение каждого пассажа вируса?

16 Для чего проводят замораживание и оттаивание патологических мате­риалов перед следующим пассажем?

17 Почему перед заражением культуры клеток монослой ее необходимо отмывать?