Таким образом, прочность водородных связей значительно меньше, чем прочность обычных ковалентных связей.

Для определения С-концевых аминокислот чаще всего используют фермент карбоксипептидазу. Это пищеварительный фермент, который выделяют из желудочного сока млекопитающих. Этот фермент специфически расщепляет ту пептидную связь, которая находится рядом со свободной карбоксильной группой. Если полипептидную цепь обработать карбоксипептидазой, то этот фермент в первую очередь отшепит только одну аминокислоту от всей цепочки, а именно С-концевую аминокислоту. Для установления структуры С-концевой аминокислоты этим способом исследуют кинетику процесса накопления образовавшихся в процессе ферментативного расщепления аминокислот в продуктах реакции. Поскольку фермент отщепляет все концевые аминокислоты (не только те, что имеются в исходном белке, но и вновь образующиеся после отщепления), то определить структуру С-концевой аминокислоты в исходной пептидной цепи можно по скорости ее накопления или по количеству образовавшейся аминокислоты в начальный момент времени. В идеальном случае с максимальной скоростью будет образовываться аминокислота, являющаяся С-концевой в исходном белке (концентрация максимальна). С меньшими скоростями будут накапливаться вторая со стороны С-конца, третья и т.д. аминокислоты. Таким образом удается установить последовательность из нескольких аминокислотных остатков (до 10 и более) в пептидной цепи со стороны ее С-концевой аминокислоты. Метод был предложен Ленсоном в 1949 г. Он имеет ряд недостатков, которые часто затрудняют установление структуры С-концевой аминокислоты. Это следующие недостатки:

- различия в скоростях отщепления разных аминокислот при прочих равных условиях. Наиболее легко отщепляются ароматические, затем следуют аминокислоты с длинной алифатической цепью и затем с короткой цепью;

- очень медленно отщепляются дикарбоновые и диаминовые аминокислоты;

-совсем не отщепляются пролин и оксипролин;

- скорость отщепления зависит от структуры предконцевой аминокислоты и общей структуры молекулы белка.

Все это требует в ряде случаев дополнительной проверки полученных этим методом данных. Так, например, если фермент не отщепляет С-концевую аминокислоту, то нельзя сказать блокирована она или это пролин или оксипролин.

Для анализа аминокислот, образовавшиейся при определении N и С-концевых аминокислот используют различные методы: тонкослойную хроматографию, колоночную хроматографию, газожидкостную хроматографию (ГЖХ). Однако с появлением автоматических анализаторов аминокислот метод ГЖХ утратил свою ценность и применяется все реже.

Известно, что некоторые протеолитические ферменты расщепляют строго определенные пептидные связи, в которых участвует та или иная аминокислота, например, тирозин. Другие ферменты, например, трипсин, специфически действует на пептидные связи, в образовании которых участвуют аргинин или лизин. Предположим, что действуем на белок ферментом, расщепляющим связи, в образовании которых участвует аргинин. В белке эта аминокислота, допустим, является четвертой справа. Тогда под действием указанного фермента получаем трипептид, содержащий N-концевую аминокислоту и остальную часть полипептидной цепочки. Далее этот трипептид и остальную часть молекулы можно подвергнуть анализу и определить их N и С-концевые аминокислоты.

Таким образом, путем сочетания постепенного гидролиза с определением С-концевых и N-концевых аминокислот можно расшифровать структуру белка. Таким способом была расшифрована первичная структура рада белков. Так, например, было определено строение инсулина-гормона, выделяемого поджелудочной железой человека и животных. Оказалось, что молекула инсулина состоит из двух полипептидных цепочек. Одна содержит 21 аминокислотный остаток, а вторая – 30. Таким образом, всего в состав молекулы инсулина входит 51 аминокислотный остаток. Расшифровка структуры молекулы инсулина была осуществлена Сенгером. Предложенная Сенгером структура инсулина блестяще подтвердилась, поскольку удалось произвести полный химический синтез этого белка. Таким же способом была расшифрована первичная структура молекулы рибонуклеазы – фермента, расщепляющего РНК.

Из рисунка видно, что молекула рибонуклеазы представляет собой длинную полипептидную цепочку, состоящую из 124 аминокислотных остатков, в которой N – концевой аминокислотой является лизин, а С- концевой – валин.

Следует сказать, что нумерацию аминокислотначинают от N-концевой аминокислоты.

Молекула инсулина состоит из двух полипептидных цепочек, связанных между собой двумя мостиками – дисульфидными связями. Имеется еще один мостик, который стягивает более короткую полипептидную цепочку. Дисульфидные мостики образуются двумя остатками цистеина. Дисульфидные связи разрываются при их восстановлении. При этом образуются две полипептидные цепочки в свободном виде. При этом инсулин полностью теряет свою биологическую активность.

В молекуле рибонуклеазы имеется четыре дисульфидных связи. Они скрепляют длинную полипептидную цепочку, которая как бы свертывается в клубок. Если разрушить дисульфидные свяи, то рибонуклеаза теряет свою ферментативную активность. Однако, если, например, путем продувания воздуха через раствор окислить образовавшиеся сульфгидрильные группы, то в белке снова обрауются дисульфидные связи. При этом может восстановиться первоначальная структура молекулы белка и его ферментативная активность.

Таким образом, в молекуле белка, кроме полипептидных связей, имеется еще один вид ковалентных связей, а именно дисульфидные связи,которые либо скрепляют между собой отдельные полипептидные цепочки, либо «стягивают» одну и ту же полипептидную цепочку. Необходимо сказать, что содержащиеся в белках сульфгидрильные группы – SH имеют значение для проявления активности ферментов.

Если представить себе полипептидную цепочку белка, то возникает вопрос, каким образом эта длинная цепочка расположена в пространстве и какие связи поддерживают эту пространственную структуру молекулы ?

Здесь на первый план выступают, так называемые водородные связи.Как известно, водородные связи являются связями нековалентными. Для того чтобы разорвать обычную химическую (ковалентную) связь, необходимо затратить от 20 до 200 ккал, то для разрыва одной водородной связи в водной среде нужно затратить всего лишь 1,5 ккал на моль.