ВСПОМОГАТЕЛЬНЫЕ УСТРОЙСТВА ДЛЯ ВЭЖХ

Содержание

СИСТЕМЫ РЕГИСТРАЦИИ И ОБРАБОТКИ ДАННЫХ

1. Самописцы

2. Интеграторы

ВСПОМОГАТЕЛЬНЫЕ УСТРОЙСТВА ДЛЯ ВЭЖХ

1 Сосуды для подвижной фазы

2. Проточные фильтры

3. Устройства для измерения давления

4. Демпферы

5. Шприцы для ввода проб

6. Измерители скорости потока

7. Термостаты колонок

КОНСТРУКЦИОННЫЕ МАТЕРИАЛЫ ДЛЯ ВЭЖХ, ТРЕБОВАНИЯ К ИХ ХИМИЧЕСКОЙ СТОЙКОСТИ И ПРОЧНОСТИ

Литература

СИСТЕМЫ РЕГИСТРАЦИИ И ОБРАБОТКИ ДАННЫХ

1. Самописцы

Для записи сигнала детектора в ВЭЖХ нужно использовать высококачественные самописцы, способные без искажений регистрировать узкие пики. Наилучшие результаты получают на приборах с высоким входным сопротивлением (≥1 МОм) и скоростью движения пера 0,5—1 с на всю ширину шкалы. Самописец должен иметь не менее 5 скоростей протяжки бумаги в диапазоне 0,2—5 см/мин, ширину ленты не менее 200 мм и эффективное подавление шумов электросети. В связи с тем, что детекторы разных типов, как правило, имеют различное напряжение выходного сигнала, очень желательно наличие переключения входа самописца на 1, 10 и 100 мВ, а также регулирование нуля в пределах всей шкалы. Для одновременной работы на двух детекторах целесообразно использовать двухперьевой самописец. Кроме того, многие наиболее современные самописцы оснащаются дополнительными устройствами, в частности обратной перемоткой ленты, что очень удобно для сравнительной записи хроматограмм, отметчиками начала регистрации, устройствами для автоматического подъема пера при выходе за пределы ленты и «ДИСК»-интеграторами.

2. Интеграторы

Механические интеграторы типа «ДИСК», описанные во многих руководствах по газовой хроматографии, до сих пор используют достаточно широко. Они дают хорошие результаты при измерении пиков неправильной формы, но ошибка заметно увеличивается при дрейфе базовой линии и неполном разделении пиков. Кроме того, их точность зависит от характеристик самописца и существенно снижается, если пик выходит за пределы шкалы. Электронные цифровые интеграторы представляют собой высокоточные приборы, автоматически измеряющие время удерживания и площадь пиков, которые фиксируются печатающим устройством. Более сложные модели интеграторов учитывают дрейф базовой линии, рассчитывают плохо разделенные пики методом перпендикуляра, а пики малой площади, выходящие на «хвосте» другого пика,— по наклонной нулевой линии, тангенс угла наклона которой определяется автоматически. Значительно большими возможностями обладают современные интеграторы с элементами вычислительной техники. Они имеют память и набор различных программ для обработки данных. Тип обработки выбирает оператор. Эти устройства регистрируют хроматограмму и по окончании разделения немедленно печатают результаты расчета состава смеси, что особенно важно для серийного количественного анализа. Точностные характеристики данных систем, как правило, выше, чем у хроматографов, поэтому ошибки определения минимальны. Компьютерные системы обработки данных являются наиболее сложными и дорогими. Они делятся на две группы. Устройства первой группы предназначены только для обработки данных и представляют собой малогабаритные вычислительные машины с большим объемом памяти, которые выполняют разнообразные сложные расчеты (например, в эксклюзионной хроматографии) и представляют результаты в цифровой и графической форме. Устройства, относящиеся ко второй группе, кроме обработки данных, осуществляют управление различными элементами хроматографической системы. К таким элементам относят, в частности, установку параметров процесса (температура, скорость потока, условия детектирования и др.) и состав подвижной фазы в изократическом и градиентном элюировании, режим работы автоматического дозатора и т.п. Все необходимые параметры постоянно контролируются, что гарантирует их стабильность в процессе разделения. Применение компьютерных систем позволяет исследователю осуществить практически любые аналитические комбинации по составленной им программе. Даже столь краткая информация дает представление о поистине безграничных возможностях применения компьютерной техники в хроматографии. Более детальное обсуждение этого вопроса выходит за рамки данной книги.

ВСПОМОГАТЕЛЬНЫЕ УСТРОЙСТВА ДЛЯ ВЭЖХ

Наряду с основными узлами, описанными выше, в хроматографическую систему входит ряд вспомогательных элементов и принадлежностей, описание которых приведено ниже.

1 Сосуды для подвижной фазы

Вместимость сосуда должна обеспечить дневную потребность растворителя без его замены. При односменной аналитической работе удобны стеклянные бутылки вместимостью 0,7— 1 л. Для повышения безопасности при круглосуточной или препаративной работе лучше использовать резервуары из нержавеющей стали вместимостью 5—20 л. В отдельных случаях (применение легко окисляющихся или особо взрывоопасных растворителей) пространство над жидкостью продувают с небольшой скоростью инертным газом. Большое значение имеет тщательная дегазация подвижной фазы. Предпочтительнее выполнять эту операцию непосредственно в рассматриваемом сосуде, чтобы исключить переливание растворителя. При использовании смешанных подвижных фаз, особенно, если их компоненты заметно различаются по температуре кипения, весьма желательно непрерывно перемешивать содержимое сосуда магнитной мешалкой для поддержания однородности системы. Некоторые приборы комплектуются специальными сосудами для подвижной фазы, которые в наибольшей степени удовлетворяют перечисленным требованиям, однако хорошие результаты можно получить и на значительно более простых системах. Так, при осуществлении дегазации продувкой гелием в качестве сосуда используют стандартную стеклянную бутыль с завинчивающейся полиэтиленовой крышкой, в которую помещают элемент магнитной мешалки. В крышке проделывают два отверстия, через которые вводят трубки подачи гелия и отбора растворителя. Трубки не должны доходить до дна бутыли на такое расстояние, чтобы за них не задевал магнитный элемент. Избыток газа выходит в атмосферу через зазоры между трубками и крышкой.

2. Проточные фильтры

Основная часть механических загрязнений попадает в подвижную фазу с атмосферной пылью. Присутствие механических примесей в растворителе недопустимо, так как они нарушают нормальную работу насосов, дозаторов и колонок. Мягкие волокнистые частицы наиболее интенсивно засоряют клапаны насоса, а твердые абразивные частицы, кроме того, могут поцарапать поршень и повредить его уплотнение. В хроматографической системе может быть установлено от одного до трех фильтров, различающихся по назначению и техническим характеристикам. Для удаления механических примесей из растворителя применяют фильтр низкого давления с большой поверхностью, расположенный до входа в насос. Наиболее распространенный фильтр этого типа представляет собой полый цилиндр из металлокерамики или пористой нержавеющей стали со штуцером для отвода очищенного растворителя из внутреннего пространства цилиндра. При помощи штуцера фильтр укрепляют на конце фторопластовой трубки и опускают в сосуд с подвижной фазой. Другой конец трубки соединяют с входом насоса. Обычно используют фильтры с размером пор 2—5 мкм. Растворитель протекает через фильтр за счет вакуума, создаваемого насосом в такте всасывания. Чтобы обеспечить нормальное перезаполнение насоса, сопротивление фильтра должно быть минимальным. Поэтому при высоких скоростях потока, в частности в препаративной хроматографии, используют фильтры большого размера. Установка фильтра низкого давления является обязательной! В процессе работы насоса постепенно изнашиваются уплотнения поршней. Продукты эрозии уплотнений медленно, но верно забивают каналы инжектора и входной фильтр колонки. Для удаления этих частиц рекомендуется устанавливать между насосом и инжектором второй фильтр, рассчитанный на высокое давление. Размер его пор не должен быть больше, чем у входного фильтра колонки. Этот фильтр при достаточном размере поверхности должен иметь возможно меньший объем, что является существенным для работы в режиме градиентного элюирования, если градиент формируется в зоне низкого давления. Третий фильтр с размером пор 0,5—2 мкм иногда устанавливают непосредственно перед колонкой. Предколоночный фильтр защищает колонку от продуктов эрозии уплотнения инжектора и от примесей, содержащихся в пробе. Этот фильтр должен иметь очень маленький мертвый объем, так как он расположен в критической зоне, где любое увеличение объема приводит к размыванию полосы, т. е. снижает эффективность разделения. Лучшие конструкции данного фильтра имеют мертвый объем 4—7 мкл. Наиболее целесообразно использовать предколоночный фильтр в эксклюзионной хроматографии полимеров, так как в этом случае вероятность присутствия нерастворимых частиц в анализируемых образцах гораздо выше, чем при анализе смесей индивидуальных соединений. При установке такого фильтра в систему с общей эффективностью 20000 т.т., включающую две эксклюзионные колонки длиной по 30 см, потеря эффективности составляет 1000—1500 т.т. В других вариантах жидкостной хроматографии широко применяют предколонки. Они защищают основную колонку как от химических, так и от механических загрязнений, т. е. являются высокоэффективными фильтрующими элементами.

3. Устройства для измерения давления

Рабочее давление в жидкостной хроматографии является очень важным параметром, который обязательно должен контролироваться. Измерители давления устанавливают на выходе насоса. В комплектных приборах и многих насосных системах в качестве измерителей давления используют тензодатчики с цифровой индикацией показаний. Они имеют высокую точность и малый внутренний объем, что позволяет быстро заменять растворитель в системе. Кроме того, информация о давлении, передаваемая в виде электрического сигнала, дает возможность реализовать простую схему установки предельно допустимого диапазона давлений, при отклонении от которого насос автоматически отключается. К недостаткам этих устройств можно отнести усложнение аппаратуры и высокую цену. Если насосная система не снабжена тензодатчиком, обычно применяют манометры с трубкой Бурдона. Они достаточно надежны, просты, дешевы и обладают демпфирующими свойствами. Главными недостатками манометров в условиях ВЭЖХ являются большой не промываемый объем, ограниченная коррозионная стойкость и меньшая, чем у тензодатчиков, точность измерения. Проявление указанных недостатков можно существенно уменьшить путем выбора манометра с оптимальным диапазоном измерения и его присоединения к системе через длинный капилляр с внутренним диаметром ≤0,5 мм. Некоторыми фирмами выпускаются также проточные манометры, не имеющие не промываемого объема.

4. Демпферы

Поршневые и диафрагменные насосы, наиболее широко используемые в современной ВЭЖХ, создают пульсирующие потоки, что затрудняет детектирование и приводит к ухудшению характеристик колонок. Для сглаживания пульсации используют различные демпфирующие устройства, вместимость которых изменяется с изменением давления. Так, в трубках Бурдона изменение объема происходит за счет сжатия и расширения находящегося в них газа. Простейший демпфер состоит из манометра Бурдона и гидравлического сопротивления, в качестве которого обычно используют длинный отрезок стального капилляра с внутренним диаметром ≤0,5 мм. Если трубка манометра заполнена жидкостью, происходит только сглаживание пульсации за счет рассеивания части энергии сжатой жидкости при разгибании трубки, и эффективность демпфирования снижается. Падение давления в таком демпфере зависит от сопротивления капилляра и может достигать 3—4 МПа. Хорошими демпфирующими свойствами обладают прокатанные (сплющенные) тонкостенные трубки из нержавеющей стали, свернутые в плотную спираль в виде пружины. Устройство, изготовленное из трубки длиной 1,8 м с наружным диаметром около 6 мм и толщиной стенки 0,5 мм, снижает уровень пульсации на 95% при рабочем давлении до 20 МПа. Демпферы этого типа нетрудно изготовить самостоятельно, прокатав трубку на вальцах. Варьируя диаметр, толщины и преимущество: растворитель, находящийся в манометре, практически не может попасть в поток подвижной фазы. длину трубки, получают демпферы с наибольшей эффективностью в определенном диапазоне рабочего давления. Эффективность демпфера пропорциональна длине трубки, а «жесткость» возрастает с уменьшением ее диаметра. Эти устройства выгодно отличаются от трубок Бурдона отсутствием не промываемого объема, но последний часто слишком велик, что ограничивает их использование при градиентном элюировании. Эти демпферы обычно включают по проточной схеме (рис.1, а). По некоторым данным, включение по схеме 8.17, б повышает эффективность демпфирования. Для промывки устройства при смене растворителя предусмотрен кран 4.

Рис.1 Варианты включения демпфера в хроматографическую систему 1 — манометр; 2 — демпфер; 3 — поперечное сечение демпфера; 4 — запорный кран

В мембранных демпферах колебания потока сглаживаются |йа счет перемещения упругой металлической диафрагмы (мембраны); с другой стороны к мембране приложено постоянное давление, создаваемое газом, пружиной или жидкостью с высоким коэффициентом сжимаемости. Лучшие конструкции мембранных демпферов имеют очень маленький внутренний объем и являются наиболее пригодными для работы с градиентным элюированием.

5. Шприцы для ввода проб

В ВЭЖХ пробу вводят в дозатор при помощи микрошприцов. Шприцы, применяемые для ввода в петлевые краны-дозаторы, в принципе аналогичны используемым в газовой хроматографии, но снабжены иглой, кончик которой обрезан перпендикулярно оси. Шприцы различаются по способу крепления иглы (вклеенная или сменная) и по уплотнению рабочей пары (притертый металлический плунжер или шток с фторопластовым уплотнением). Самые простые и дешевые шприцы имеют вклеенную иглу и металлический плунжер. Шприцы с фторопластовым уплотнением (Gas Tight) характеризуются повышенной коррозионной стойкостью и герметичностью: через уплотнение не происходит утечки газа при его давлении до 0,8—1,5 МПа. Кроме того, они гораздо легче отмываются, а изношенный уплотняющий элемент достаточно просто заменить. Эти шприцы особенно рекомендуются для работы с высокополярными и коррозионно-активными веществами и с подвижной фазами, представляющими собой солевые и буферные растворы. Практически все шприцы со сменной иглой можно применять как в газовой, так и в жидкостной хроматографии: нужно только установить в них соответствующую иглу. При работе с кранами-дозаторами, рассчитанными на частичное заполнение дозы, с целью повышения точности вводимого объема пробы следует использовать шприцы минимально возможного объема (обычно от 10 до 50 мкл). При полном заполнении петли вместимость шприца должна быть как минимум вдвое больше объема дозы. В эксклюзионной хроматографии, как правило, вводят полную дозу, объем которой значительно больше, чем в других видах ВЭЖХ, и составляет 50—300 мкл. В соответствующих кранах-дозаторах канал ввода пробы обычно оснащен герметично закрепленной иглой, в которую вставляют шприц, предназначенный для работы с обычными съемными (не путать со сменными) иглами. Для таких дозаторов лучше всего использовать шприцы вместимостью 100—1000 мкл с фторопластовыми уплотнением и посадочным конусом (например, шприцы Гамильтон, типа TLL), так как в случае стеклянного или металлического посадочного конуса герметичность этого соединения нарушается значительно быстрее. Такие же шприцы применяют и в препаративной ВЭЖХ. Для введения пробы непосредственно в поток элюента через прокалываемую мембрану (шприцевые дозаторы) используют специальные шприцы с углом заточки иглы 22°. Эти шприцы имеют особые уплотнения, рассчитанные на давления до 35 МП а, и оснащены защитными приспособлениями, предотвращающими выбрасывание поршня в момент прокола мембраны. Если давление в колонке не превышает 7—10 МПа, можно применять шприцы вместимостью до 50 мкл с фторопластовым уплотнением поршня.

6. Измерители скорости потока

Скорость потока и ее стабильность во времени существенно влияют на правильность и воспроизводимость характеристик удержания в ВЭЖХ. Эти параметры особенно важны в эксклюзионной хроматографии, где даже незначительное изменение скорости потока приводит к большим ошибкам определения молекулярных масс полимеров. Кроме того, изменение скорости потока указывает на неполадки в аппаратуре (например, негерметичность жидкостного тракта или засорение клапанов насоса), поэтому желательно измерять ее не менее двух-трех раз в день.

Скорость потока можно определять, взвешивая растворитель, вытекающий из колонки за определенный промежуток времени; метод достаточно точен (ошибка менее 0,5%), но неудобен и длителен. Скорость потока часто находят по времени заполнения определенного объема бюретки или стеклянной трубки, ограниченного двумя рисками. В варианте, показанном на рис. 8.18, а, растворитель поступает в расходомер сверху, а в варианте 8.18,6—снизу.

Рис. 2. Расходомеры: а—типа бюретки; б—с подачей растворителя снизу; а — пузырьковый

На рис. 8.18,б показан пузырьковый расходомер, в котором вводят шприцом в элюат пузырек воздуха и измеряют время прохождения пузырька между рисками. Эти расходомеры удобны в работе и дают погрешность около 1%, измерение занимает не более 2—3 мин.

7. Термостаты колонок

Повышение температуры разделения улучшает эффективность колонок в обращенно-фазной, ионообменной и эксклюэиюнной хроматографии. Стабилизация температуры также повышает точность количественных определений, поэтому использование термостатов—весьма желательно, а иногда обязательно. В ВЭЖХ чаще всего применяют воздушные термостаты с интенсивным перемешиванием воздуха, в которых расположены теплообменник для подогрева растворителя, дозатор и колонки. Для обеспечения безопасности работы термостат продувают азотом и часто устанавливают в нем датчики, реагирующие на появление паров органических растворителей и включающие световую или звуковую сигнализацию. Защиту от перегрева, который может произойти при неисправности электронной схемы, осуществляют включением в электрическую цепь специальных вставок, изготовленных из сплавов с температурой плавления 100-150°С. Иногда для термостатирования используют нагреваемые металлические блоки с профрезерованными пазами, в которые вставляются колонки, а также водяные рубашки, соединенные с жидкостными термостатами. Главная трудность использования этих конструкций заключается в том, что размер пазов и рубашек должен строго coответствовать размеру и числу колонок и предколонок. В то же время в практике часто приходится собирать разделительные системы из колонок различных размеров. Это обстоятельство затрудняет использование указанных термостатирующих устройств, несмотря на их простоту. Кроме того, эти устройства обычно не предусматривают термостатирования инжектора и предварительного подогрева растворителя. Для проведения большинства работ в ВЭЖХ вполне достаточным является диапазон термостатирования до 100°С с точностью поддержания температуры ±0,5-1 °С. В отдельных случаях, в частности в эксклюзионной хроматографии некоторых синтетических полимеров, необходимо термостатирование 1 до 150 °С.