Репликативное бессмертие

Опухолевым клеткам необходим неограниченный потенциал репликации для получения адекватного количества клеток, формирующих макроскопические опухоли. Это свойство резко отличает их от нормальных клеток, которые имеют ограниченное число циклов деления. При размножении клеток в культуре циклы деления приводят, в первую очередь, к индукции физиологического старения, а клетки, успешно обошедшие это ограничение, переходят в фазу кризиса, в которой большинство клеток в популяции погибает. В редких случаях клетки, пережившие состояние кризиса, приобретают способность к неограниченной репликации. Такие клетки способны пролиферировать в культуре без признаков физиологического старения.

Многие исследования показывают, что теломеры являются ДНК-структурами, которые защищают концы хромосом, эти структуры связаны со способностью клетки к неограниченной репликации. Теломеры состоят из тандемно повторяющихся последовательностей (-ТТТАGGG-)*n, и с каждым делением постепенно укорачиваются в обычных клетках, в результате чего теряется способность защищать концы хромосом от соединения друг с другом. Такое соединение создает нестабильные перестроенные хромосомы, в результате происходит дестабилизация кариотипа, которая угрожает жизнеспособности клетки. Соответственно, длина теломер в клетке определяет количество поколений ее потомства, прежде чем произойдет разрушение теломер и будут утрачены их защитные функции.

Теломераза - специфическая ДНК-полимераза, которая добавляет теломерные повторы на конце теломерной ДНК. Функция этого белка почти отсутствует в обычных клетках, но его экспрессия повышена в подавляющем большинстве (примерно 90%) бессмертных клеток, включая опухолевые клетки человека.

Теломераза удлиняет теломерную ДНК, чем противостоит разрушению теломер. Наличие теломеразной активности в клетках культуры, специально сконструированных для изучения экспрессии этого фермента, связано с устойчивостью к физиологическому старению, и наоборот, инактивация теломеразы ведет к укорочению теломер и активации антипролиферативной функции.

Физиологическое старение и апоптоз обусловливают противоопухолевую защиту клеток. Такая программа генетически заложена в клетки, и она работает, чтобы препятствовать росту неопластических клонов.

Возможное бессмертие клеток, которые формируют опухоль, объясняется их способностью поддерживать определенную длину теломерной ДНК, которая позволяет избегать запуска физиологического старения или апоптоза. Сокращение длины теломер рассматривается как часовой механизм, который ограничивает репликативный потенциал нормальных клеток и, следовательно, нарушается в клетках опухоли.

В настоящее время имеется свидетельство того, что клоны молодых предопухолевых клеток часто сталкиваются с кризисом, вызванным потерей теломер, относительно рано из-за их неспособности экспрессировать необходимое количество теломеразы. Экспериментально показано значительное укорачивание теломер, а также слияние хромосомных концов в предопухолевых образованиях. Можно предположить, что такие клетки прошли через большое число нормальных делений с укорачиванием теломер. Следовательно, развитие некоторых неоплазий человека можно предотвратить, индуцируя сокращением теломер.

Важность временного недостатка теломерных последовательностей показана также при сравнительном анализе пренеопластических и злокачественных поражений молочной железы человека. В предраковых образованиях не отмечено заметной экспрессии теломеразы, но обнаружены укорачивания теломер и хромосомные нарушения. Наоборот, в карциномах обнаружена повышенная экспрессия теломеразы, реконструкция длины теломер и нарушения кариотипа, которые,
по-видимому, образовывались до появления повышенной теломеразной активности. Обнаруженные факты показывают, что задержка теломеразной активности способствует появлению мутаций в опухолевых клетках, в то время как ее активация стабилизирует мутантный геном и способствует неограниченной репликации, которая необходима клеткам опухоли для возникновения клинически определяемых новообразований.

Исследования теломеразы предполагали, что основная функция фермента состоит в удлинении и сохранении теломерной ДНК. Однако в последние годы стало ясно, что теломераза необходима для пролиферации клетки. При исследованиях на мышах и в культурах клеток обнаружена дополнительная роль теломеразы, в частности ее белковой субъединицы ТЕЯХ Белковая субъединица теломеразы

ТЕЯТ может быть кофактором комплекса р-катенин/фактор транскрипции 1_Е! усиливая сигналы Wnt-пути. Теломераза, независимо от действия на теломеры, повышает пролиферацию клеток и/или устойчивость к апоптозу, участвует в исправлении повреждений ДНК и в реакции РНК-зависимой РНК-полимеразы. В дополнение ТЕЯТ может связываться с хроматином на множественных сайтах, расположенных по всей длине хромосом, а не только с теломерами.

Индукция ангиогенеза

Опухолям, как и нормальным тканям, для жизни необходимы питательные вещества и кислород, а также удаление продуктов метаболизма и углекислого газа. Этим потребностям отвечает неоваскуляризация, образование сети новых кровеносных сосудов в опухоли. В эмбриогенезе развитие сосудистой сети связано с образованием новых эндотелиальных клеток, их агрегацией в трубочки (васку-логенез) и образованием новых сосудов (ангиогенез). После такого морфогенеза нормальная сосудистая сеть приходит к состоянию покоя.

Во взрослом организме ангиогенез имеет место только временно, как часть физиологических процессов, например при заживлении ран или в женском репродуктивном цикле. Напротив, при прогрессии опухоли ангиогенез всегда активирован, стимулируя образование новых сосудов, что помогает поддерживать рост новообразования.

Убедительно показано, что ангиогенные регуляторы являются сигнальными белками, которые связываются с рецепторами на поверхности эндотелиальных клеток сосудов. Хорошо известны индукторы и ингибиторы ангиогенеза, такие как эндотелиальный фактор роста сосудов (VEGFA) и тромбоспондин (ТБР-1).

Ген УЕв-Л кодирует лиганды, которые регулируют рост новых кровеносных сосудов в эмбриональном и постнатальном развитии, а у взрослых - гомеостатическую выживаемость эндотелиальных клеток при физиологических и патологических состояниях. Сигнальная молекула VEGF взаимодействует с тремя тирозин-киназными рецепторами (VEGFR-1, 2, 3), и это взаимодействие регулируется на многих уровнях. Экспрессия гена УЕв-А может повышаться как при гипоксии, так и при действии онкогенов. Кроме того, VEGFлиганды могут существовать в латентных формах во внеклеточном матриксе, которые активируются действием протеаз внеклеточного матрикса (например, ММР-9). Другие проангиогенные молекулы, члены семейства факторов роста фибробластов (FGF), связаны с поддержкой опухолевого ангиогенеза, если их экспрессия хронически повышена.

Сосуды внутри опухолей хронически активированы, но процессы ангиогенеза в опухолях отличны от нормальных тканей. При опухолевой неоваскуляризации отмечается ранний рост капилляров, изогнутость и избыточное ветвление сосудов, рыхлость, их деформация и увеличение, неустойчивый кровоток, микрокровотечения, необычный уровень пролиферации эндотелиальных клеток и их апоптоз.

При многоступенчатом развитии инвазивного рака ангиогенез индуцируется рано как на модельных животных, так и у людей. При гистологическом анализе предопухолевых, неинвазивных повреждений, включая дисплазии, а также при карциномах in situ, обнаруживают раннее нарушение ангиогенеза.

При активации ангиогенеза в опухолях характер неоваскуляризации может быть различный. В некоторых опухолях (например, в протоковых аденокарциномах поджелудочной железы) новых сосудов образуется мало, в них много стромальных участков, в которых отсутствуют сосуды, а другие опухоли (включая опухоли почек) высокоангиогенны и, следовательно, в них развита плотная сосудистая сеть.

Большинство регуляторов ангиогенеза - это белки, которые образуются в результате протеолитического расщепления других структурных белков, не относящихся к ангиогенезу. Некоторые из эндогенных ингибиторов ангиогенеза могут быть обнаружены в крови нормальных людей и животных. Удаление генов, кодирующих некоторые эндогенные ингибиторы ангио-генеза, не оказывает физиологического влияния на соответствующих модельных животных, однако, как следствие, усиливает рост аутогенных и имплантированных опухолей. Наоборот, если уровень циркулирующих эндогенных ингибиторов у трансгенных мышей увеличивался, рост опухоли замедлялся.

В настоящее время ясно, что почти весь спектр клеток, источником которых является костный мозг, играет решающую роль в развитии патологического ангио-генеза. Клетки иммунной системы, макрофаги, нейтрофилы, тучные клетки и предшественники миелоидных клеток инфильтрируют предопухолевые образования и прогрессирующие опухоли и располагаются на границе этих поражений. Окружающие опухоль воспалительные клетки запускают ангиогенез в тканях, ранее находящихся в покое, а также поддерживают постоянный ангиогенез, связанный с ростом опухоли, чем способствуют локальной инвазии. Кроме того, они могут способствовать защите сосудистой сети от действия лекарств, мишенью которых являются эндотелиальные сигнальные клетки.

Сосудистая сеть опухолей испытывает значительный недостаток в перицитах, которые выполняют важную механическую и физиологическую роль для эндотелиальных клеток в сосудистой сети нормальных тканей.

Метастазирование

До недавнего времени механизмы инвазии и метастазирования понимали недостаточно. Было ясно, что карциномы прогрессируют в патологически высокую степень злокачественности, что отражается в локальной инвазии и отдаленных метастазах, а опухолевые клетки со временем обычно не только изменяют свою форму, но и теряют связь с другими клетками и внеклеточным матриксом. Такие изменения видны при потере клетками опухоли Е-кадгерина, ключевой молекулы клеточной адгезии. С помощью Е-кадгерина формируются плотные контакты между эпителиальными клетками, что обусловливает образование слоев и неподвижность клеток внутри этих слоев. Показано, что повышенная экспрессия Е-кадгерина является антагонистом инвазии и метастазирования, в то время как снижение его экспрессии способствует приобретению этих фенотипов. Часто наблюдаемое подавление активности Е-кадгерина и его случайная инактивация в карциномах человека убедительно доказывает роль Е-кадгерина как ключевого супрессора инвазии и метастазирования.

Кроме того, в высокоагрессивных опухолях изменяется экспрессия генов, кодирующих молекулы адгезии между клетками, а также между клетками и матриксом. Экспрессия адгезионных белков, обеспечивающих плотный контакт между эпителиальными клетками, значительно снижается, а уровень молекул адгезии, стимулирующих миграцию клеток в эмбриогенезе и при воспалении, напротив, повышается. При снижении экспрессии Е-кадхерина повышается уровень И-кадхерина, который в норме экспрессируется в мигрирующих нейронах и мезенхимальных клетках при органогенезе.

Многоступенчатый процесс инвазии и метастазирования, который часто называют каскадом инвазии/метастазирования, можно представить как последовательность отдельных этапов. Сначала происходят клеточно-биологические изменения, связанные с локальной инвазией. Затем следует инвазия опухолевых клеток в соседние кровяные и лимфатические сосуды. После переноса клеток лимфатической и кровеносной системой в отдаленные районы происходит выход опухолевых клеток из сосудов в паренхиму удаленных тканей (экстравазация) и формирование микрометастазов и, наконец, рост микрометастазов в макроскопические опухоли. Последняя стадия называется «колонизацией».

За последнее десятилетие достигнут значительный прогресс в понимании сложных механизмов инвазии и метастазирования опухолей, идентифицированы регулирующие их гены. Это стало возможным благодаря разработке и внедрению современных методов молекулярно-биологических исследований и улучшению экспериментальных моделей.

Основным регулятором инвазии и метастазирования сегодня считается механизм эпителиально-мезенхимального перехода (ЭМП). Исследования механизма ЭМП тесно связаны с изучением трансформированных эпителиальных клеток, которые приобретают способность к инвазии, резистентность к апоптозу и диссеминации. Наряду с его участием в процессах, связанных с разными стадиями эмбрионального морфогенеза и заживлением ран, которые необходимы для нормального функционирования организма, клетки могут приобретать злокачественные свойства, способствующие инвазии и метастазированию. Механизм ЭМП может активироваться как кратковременно, так и на продолжительное время, в зависимости от степени инвазии и метастазирования раковых клеток.

ЭМП и родственные процессы миграции при эмбриогенезе регулирует ряд совместно действующих транскрипционных факторов, в числе которых Snail, Slug, Twist и Zeb1/2. Эти транскрипционные регуляторы экспрессируются в различных типах злокачественных опухолей. В экспериментальных моделях формирования карциномы показана их значимость для механизма инвазии, а при метастазах обнаружена эктопическая гиперэкспрессия некоторых из них. Эти транскрипционные факторы вызывают ряд биологических изменений, к которым относится потеря адгезионных контактов, изменение морфологической формы клетки из полигональной/эпителиальной в веретенообразную/фибробластическую форму, экспрессия ферментов, разрушающих внеклеточный матрикс, повышение

подвижности клетки и резистентность к апоптозу. Все эти процессы характерны для опухолевой инвазии и метастазирования. Некоторые из этих транскрипционных факторов могут прямо подавлять экспрессию гена Е-кадхерина, тем самым лишая неопластические эпителиальные клетки этого ключевого супрессора подвижности и инвазивности.

Также показано, что ослабленное взаимодействие опухолевых клеток со стромальными клетками может индуцировать экспрессию фенотипов злокачественных клеток, которые, как известно, регулируются этими, одним или более, транскрипционными факторами. Опухолевые клетки, расположенные на инвазивных краях карцином, могут в большей степени подвергаться действию механизма ЭМП. Вероятно, эти клетки испытывают влияние микроокружения, которое отличается от стимулов, действующих на клетки, расположенные в глубине этих новообразований.

Становится все более очевидным, что взаимосвязь между злокачественными клетками и клетками стромы обусловливает приобретение способности к инвазивному росту и метастазированию. Сигнальный механизм может действовать как на одни, так и на другие клетки и изменять их специфические свойства. Например, мезенхимальные стволовые клетки, которые присутствуют в строме опухоли, могут секретировать ССЬ5/ RANTES в ответ на сигналы клеток опухоли, а ССЬ5, в свою очередь, действует на раковые клетки, стимулируя их инвазивное поведение.

Макрофаги периферии опухоли могут способствовать локальной инвазии, активируя металлопротеиназы и цистеин-катепсиновые протеазы - ферменты, разрушающие внеклеточный матрикс. На экспериментальной модели метастазирующего рака молочной железы показано, что ассоциированные с опухолью макрофаги обеспечивают злокачественные клетки молочной железы эпидермальным фактором роста, а те, в свою очередь, стимулируют макрофаги. Такое взаимодействие опухолевых клеток и макрофагов приводит к попаданию клеток опухоли в циркулирующую систему и их последующей метастатической диссеминации.

До сих пор неизвестно, нужны ли дополнительные мутации в клетках опухоли, для того чтобы преодолевать большинство стадий каскада инвазии-метастазирования, или для этого достаточно тех мутаций, которые были необходимы для образования первичной опухоли.