Изучения фагоцитарной активности клеток.

Фагоцитоз ― процесс, при котором специально предназначенные для этого клетки крови и

тканей организма (фагоциты) захватывают и переваривают твёрдые частицы.

Осуществляется двумя разновидностями клеток: циркулирующими в крови зернистыми

лейкоцитами (гранулоцитами) и тканевыми макрофагами.

Стадии фагоцитоза:

1. Хемотаксис. В реакции фагоцитоза более важная роль принадлежит положительному

хемотаксису. В качестве хемоаттрактантов выступают продукты выделяемые

микроорганизмами и активированными клетками в очаге воспаления (цитокины, лейкотриен

В4, гистамин), а также продукты расщепления компонентов комплемента (С3а, С5а),

протеолитические фрагменты факторов свертывания крови и фибринолиза (тромбин,

фибрин), нейропептиды, фрагменты иммуноглобулинов и др. Однако, «профессиональными»

хемотаксинами служат цитокины группы хемокинов. Ранее других клеток в очаг воспаления

мигрируют нейтрофилы, существенно позже поступают макрофаги. Скорость

хемотаксического перемещения для нейтрофилов и макрофагов сопоставима, различия во

времени поступления, вероятно, связаны с разной скоростью их активации.

2. Адгезия фагоцитов к объекту. Обусловлена наличием на поверхности фагоцитов

рецепторов для молекул, представленных на поверхности объекта (собственных или

связавшихся с ним). При фагоцитозе бактерий или старых клеток организма хозяина

происходит распознавание концевых сахаридных групп ― глюкозы, галактозы, фукозы,

маннозы и др., которые представлены на поверхности фагоцитируемых клеток.

Распознавание осуществляется лектиноподобными рецепторами соответствующей

специфичности, в первую очередь маннозосвязывающим белком и селектинами,

присутствующими на поверхности фагоцитов. В тех случаях, когда объектами фагоцитоза

являются не живые клетки, а кусочки угля, асбеста, стекла, металла и др., фагоциты

предварительно делают объект поглощения приемлемым для осуществления реакции,

окутывая его собственными продуктами, в том числе компонентами межклеточного

матрикса, который они продуцируют. Хотя фагоциты способны поглощать и разного рода

«неподготовленные» объекты, наибольшей интенсивности фагоцитарный процесс достигает

при опсонизации, т. е. фиксации на поверхности объектов опсонинов к которым у фагоцитов

есть специфические рецепторы - к Fc-фрагменту антител, компонентам системы

комплемента, фибронектину и т. д.

3. Активация мембраны. На этой стадии осуществляется подготовка объекта к погружению.

Происходит активация протеинкиназы С, выход ионов кальция из внутриклеточных депо.

Большое значение играют переходы золь-гель в системе клеточных коллоидов и актино-

миозиновые перестройки.

4. Погружение. Происходит обволакивание объекта.

5. Образование фагосомы. Замыкание мембраны, погружение объекта с частью мембраны

фагоцита внутрь клетки.

6. Образование фаголизосомы. Слияние фагосомы с лизосомами, в результате чего

образуются оптимальные условия для бактериолиза и расщепления убитой клетки.

Механизмы сближения фагосомы и лизосом неясны, вероятно имеется активное

перемещение лизосом к фагосомам.

7. Киллинг и расщепление. Велика роль клеточной стенки перевариваемой клетки. Основные

вещества участвующие в бактериолизе: пероксид водорода, продукты азотного метаболизма,

лизоцим и др. Процесс разрушения бактериальных клеток завершается благодаря активности

протеаз, нуклеаз, липаз и других ферментов, активность которых оптимальна при низких

значениях pH.

8. Выброс продуктов деградации.

Фагоцитоз может быть:

- завершённым (киллинг и переваривание прошло успешно);

- незавершённым (для ряда патогенов фагоцитоз является необходимой ступенью их жизненного цикла, например, у микобактерий и гонококков).

Кислородзависимая микробицидная активность реализуется через образование значительного количества продуктов с токсическим действием, повреждающих микроорганизмы и окружающие структуры. За их образование ответственны НЛДФ-оксидаза (флавопротедо-цитохромредуктаза) плазматической мембраны и цитохром b, в присутствии хинонов этот, комплекс трансформирует 02 в анион супероксида (02-). Последний проявляет выраженное повреждающее действие, а также быстро трансформируется в перекись водорода по схеме: 202 + Н20 = Н202 + О2 (процесс

катализирует фермент супероксид дисмутаза).

Опсонины - белки, усиливающие фагоцитоз: IgG, белки острой фазы (С-реакгивный протеин,

маннансвязывающий лектин); липополисахаридсвязывающий протеин, компоненты комплемента - СЗb, С4Ь; сурфактантные протеины легких SP-A, SP-D.

Методы изучения фагоцитарной активности клеток.

Для оценки фагоцитарной активности лейкоцитов периферической крови к цитратной крови, взятой из пальца, в объеме 0,2 мл, добавляют 0,25 мл взвеси микробной культуры с концентрацией 2 млрд. микробов в 1 мл.

Смесь инкубируют 30 мин при 37°С, центрифугируют при 1500 об/мин в течение 5-6 мин, удаляют надосадочную жидкость. Осторожно отсасывают тонкий серебристый слой лейкоцитов, готовят мазки, сушат, фиксируют, красят краской Романовского-Гимза. Препараты сушат и микроскопируют.

Подсчет поглощенных микробов ведут в 200 нейтрофилах (50 моноцитов). Интенсивность реакции оценивают по следующим показателям:

1.       Фагоцитарный показатель (фагоцитарная активность) — процент фагоцитов из числа сосчитанных клеток.

2.       Фагоцитарное число (фагоцитарный индекс) — среднее число микробов, поглощенное одним активным фагоцитом.

Для определения переваривающей способности лейкоцитов периферической крови готовят смесь взятой крови и суспензии микроорганизма и выдерживают в термостате при 37°С 2 часа. Приготовление мазков аналогично. При микроскопии препарата жизнеспособные микробные клетки увеличены в размерах, переваренные же менее интенсивно окрашены, меньших размеров. Для оценки переваривающей функции используют показатель завершенности фагоцитоза – отношение количества переваренных микробов к общему числу поглощенных микробов, выраженное в процентах.