Глава 3. Результаты исследования

 

На начальном этапе исследования производился посев разведений воды из оз. Мраморное и микроэкосистемы оз. Мраморное для выявления галофильных микроорганизмов различных трофических групп.

Спустя 7 дней инкубации в термостате при температуре 30°С был произведен просмотр колоний, выросших на данных чашках Петри. Было определено общее число колоний микроорганизмов в 1 мл воды, а также определена родовая принадлежность выросших колоний микроорганизмов.

1. Результаты исследования воды из оз. Мраморное.

Посев производился на 4 различные среды для выделения разных групп микроорганизмов:

1) Соленный МПА использовался для выявления галофильных гетеротрофов, обитающих в данных экстремальных условиях.

Общее число гетеротрофных микроорганизмов определялся посевом разведений 10^-1 и 10^-2 на твердую питательную среду- МПА глубинным способом.

В результате этого посева было определено ОМЧ:

ОМЧ=1,9*10⁴ КОЕ/мл.

На МПА, приготовленном на основе воды из оз. Мраморное, были обнаружены колонии с различными культуральными признаками. Была проведена микроскопия фиксированных и окрашенных по Грамму микроорганизмов из этих колоний и определен родовой состав микроорганизмов, образующих данные колонии (табл.2).

Таблица 2

Культуральные и морфологические признаки гетеротрофных микроорганизмов

№	Культуральные признаки	Число колоний	Морфологические признаки	Предположительный род
1	Колонии круглой формы, с гладкими краями, блестящей поверхностью, слизистой консистенции, светло-коричневого цвета	106	Г- длинные бесспоровые палочки, 1,0-3,0*2,0-3,0 мкм	р. Haloferax
2	Колония амебовидной формы с волнистым краем, изогнутый профиль, блестящая, тянущейся консистенции, зернистая, молочного цвета с темно-коричневыми включениями	251	Кокки, 0,8-1 мкм, виде скоплений неправельной формы.	р.Halococcus
3	Колония круглой формы с валиком по краю, края ровные, профель изогнутый, блестящая, слизистой консистенции, молочного цвета, по краю переходящего в коричневый.	128	Г+ бесспоровые палочки, 1,0-1,2*1,0-3,0 мкм.	р.Halobacterium
4	Колонии круглые, выпуклые, блестящие, слизистой консистенции, светло-серого цвета.	956	Г+ споровые палочки, 1,3-2,1*1,5-3,0 мкм	Bacillus
5	Колонии круглые, глянцевые, с не ровными краями, выпуклые, зернистые, желтого цвета	26	Г+ короткие палочки, объединенные в цепь, спорообразующие	Bacillus
6	Колонии неправильной формы, зернистые, глянцевые, желтого цвета	3	Г+ кокки, 1,2-1,6 мкм, объединенные в не длинные цепочки	Streptococcus
7	Колонии неправильной формы, плоские, кожистые, серого цвета	23	Г- необразующие палочки, 1,3-1,6*1,8-2,3 мкм	Providencia
8	Колонии темно-бурого цвета, точечные, глянцевые	15	Г- кокки, 1,3-15*1,6-1,9 мкм	Pseudomonas

 

2) Ср. Чапека используется для выделения грибной микрофлоры.

Посевы со ср.Чапека просматривались в течении 20 суток. В данных посевах было выявлено 4 разновидности грибов, и их общее количество на 1 мл воды составляет 50 КОЕ/мл. При прямой микроскопии данных колоний были выделены 2 рода грибов.

1. Колонии бархатистой консистенции, белого цвета по краю, в конидиальной зоне темно-зеленые. Не выделяют пигмент в агар. Предположительно данный гриб относится к роду Aspergillus .

2. Колонии бархатистой консистенции, белые как по краю, так и в конидиальной зоне, пигмент в агар не выделяют. При микроскопии был определен предположительный род данного гриба- Acr е monium .

3. Колонии с очень сильно развитым воздушным мицешием, желтого цвета, пигмент в агар не выделяют, при дальнейшем росте приобретают серо-черную окраску. Предположительно данный гриб относится к роду Aspergillus .

4. Колонии бархатистой консистенции, серо-зеленого цвета, пигмента не образуют. Предположительно относится к роду Aspergillus .

5. Колонии бархатистой консистенции, в центре колонии имеют темно-зеленую окраску, по краям колонии окраска ярко-зеленая, предположительно относится к роду Aspergillus .

3) Ср. Сабуро используется для выявления дрожжевой микрофлоры.

Счет колоний дрожжей производился 2 раза: первый раз через 5 суток и второй раз через 10 суток. Все выросшие колонии были прмикроскопированы, дрожжи были отмечены в некоторых из них. На ср. Сабуро были выявлены колонии дрожжей, их содержание в 1 мл = 120 КОЕ/мл, эти колонии имеют круглую форму, гладкие края, выпуклый профиль, блестящие, розового цвета. Производили микроскопию фиксированных мазков данных колоний, окрашенных по Граму. При микроскопии были обнаружены клетки дрожжей овальной и удлиненно- овальной формы, диаметром 6-10 мкм. Помимо дрожжевой микрофлоры было выявлено наличие колоний бактерий, но их содержание не значительно.

4) Голодный агар используется для выявления олиготрофной микрофлоры водоема.

Спустя 7 дней инкубации была определенна общая численность олиготрофов в 1 мл воды оз. Мраморное ОМЧ=3,3*10² КОЕ\мл.

При просмотре посевов отмечались культуральные и морфологические признаки выросших колоний. Морфологические признаки определялись путем микроскопии фиксированных и окрашенных по Граму мазков с исследуемых колоний (табл.3).

 

Таблица 3

Культуральные и морфологические признаки

 олиготрофных микроорганизмов

№	Культуральные признаки	Число колоний	Морфологические признаки	Предположительный род
9	Точечные колонии, матовые, плоские, серого цвета.	33	Г- длинные неправильной формы бесспоровые палочки, 1,0-3,0*2,0-3,0 мкм	Pseudomonas
10	Колонии выедающие агар		Г+ бесспоровые палочки, 1,3-2,1*1,5-3,0 мкм	Halobacterium
11	Колонии точечные, глянцевые, выпуклые, оранжевого цвета	128	Г+ кокки, 0,5-2,0 мкм, образующие скопления не правильной формы	Micrococcus
12	Колонии круглые с неровными краями, плоская, жидкой консистенции, молочного цвета	21	Г+ бесспоровые палочки, слегка изогнутые	Bacillus
13	Колонии круглые с неровными краями, зернистая, темно-коричневого цвета в центре, по краю светлые	15	Г- бесспоровые палочки, изогнутые, 1,2-1,5*2,4-2,7 мкм	Pseudomonas

 

2. Результаты исследования воды из микроэкосистемы имитирующей оз. Мраморное.

1) МПА использовался для выявления галофильных гетеротрофов, обитающих в данной микроэкосистеме.

Общее число гетеротрофных микроорганизмов определялся посевом разведений 10^-1 и 10^-2 на твердую питательную среду - МПА глубинным способом.

В результате этого посева было определено ОМЧ:

ОМЧ=9,3*10⁴ КОЕ/мл.

На МПА, приготовленном на основе воды из микроэкосистемы оз. Мраморное, были обнаружены колонии с различными культуральными признаками. Была проведена микроскопия фиксированных и окрашенных по Грамму микроорганизмов из этих колоний и определена родовая принадлежность микроорганизмов, образующих данные колонии (табл.4).

 

Таблица 4

Культуральные и морфологические признаки микроорганизмов, выросших на МПА из воды микроэкосистемы оз. Мраморное

№	Культуральные признаки	Число колоний данного типа	Морфологические признаки	Предположительный род
14	Колонии круглой формы, с гладкими краями, блестящей поверхностью, слизистой консистенции, выпуклый профиль, серого цвета	98	Г- бесспоровые палочки, 0,5-1,3*1,0-4,2 мкм	Pseudomonas
15	Колония круглой формы, размером не более 0,5 см, края ровные, профель выпуклый, блестящая, слизистой консистенции, серого цвета,	962	Г+ кокки, 0,7-1,5 мкм, одиночные или в парах,	Providencia
16	Колонии точечные, круглые, выпуклые, блестящие, слизистой консистенции, оранжевого цвета.	956	Г+ кокки, 1,0-2,3 мкм,	Micrococcus
17	Колонии круглые, с ровными краями, плоские, глянцевые, темно-коричневого цвета	214	Г+ споровые палочки, 0,8-1,2*1,3-1,6 мкм	Bacillus

 

2) Ср. Чапека используется для выделения и определения родовой принадлежности грибов.

На ср. Чапека было обнаружено родовое разнообразие грибной микрофлоры. Было выявлено 71 колония грибов по своим культуральным и морфологическим признакам разнообразные. Общее количество грибов на 1 мл воды составляет 1,3*10² КОЕ/мл. При прямой микроскопии колоний грибов были выделены несколько различных родов.

6. Колонии бархатистой консистенции, белого цвета по краю, в конидиальной зоне темно-зеленые, не выделяют пигмент в агар, предположительно относятся к роду Aspergillus.

7. Колонии бархатистой консистенции, белые как по краю, так и в конидиальной зоне, пигмент в агар не выделяют. Предположительно относятся к роду Acremonium

8. Колонии бархатистой консистенции, темно-коричневого цвета в конидиальной зоне, светло-коричневые по краю, не выделяют пигмент в агар. Предположительно относятся к роду Alternaria.

9. колонии пушистой консистенции, в центре и по краю темно-зеленого цвета, а в середине колонии белого, пигмент не выделяют. Предположительно относятся к роду Aspergillus .

10. колонии пушистой консистенции, желтго-зеленого цвета, пигмент не выделяют, предположительно относится к роду Aspergillus .

3. Ср. Сабуро используется для выявления дрожжевой микрофлоры.

Счет колоний дрожжей производился 2 раза: первый раз через 5 суток и второй раз через 10 суток. Все выросшие колонии были промикроскопированны, дрожжи были отмечены в некоторых из них. На ср. Сабуро были выявлены колонии дрожжей, их содержание в 1 мл составило 2,3*10³ КОЕ/мл, эти колонии имеют круглую форму, гладкие края, выпуклый профиль, блестящие, розового цвета. Производили микроскопию фиксированных мазков данных колоний, окрашенных по Граму. При микроскопии были обнаружены клетки дрожжей овальной формы, диаметром 5-9 мкм. Помимо дрожжевой микрофлоры было выявлено наличие колоний бактерий, но их содержание не значительно.

4. Голодный агар используется для выявления олиготрофной микрофлоры водоема.

Спустя 7 дней инкубации просматривались посевы на голодный агар, при этом было отмечено, что наблюдается рост только колоний выедающих агар. При микроскопии фиксированных и окрашенных мазков было установлено наличие Г+ бесспоровых палочек не правильной формы, 1,3-2,6*1,4-3,6 мкм, предположительно относятся к роду Halobacterium .

3) результаты исследования выделенных колоний с применением пластины биохимической дифференцирующей энтеробактерии.

Перед проведением исследования был произведен предварительный пересев культур на МПБ на 4 ч при температуре 37 °С, затем был осуществляен пересев культуры на скошенный мясо-пептонный агар. Посевы инкубировались в течение 24 ч при температуре 37 °С.

Культуру с мясо-пептонного агара используовали для приготовления суспензии в фосфатно-солевом буферном растворе рН 6,0-6,2 и в 4,0 мл стерильного фосфатно-солевого буферного раствора была внесена исследуемуемая (2-3 петли) культура до образования видимой мутности.

Затем было проведено исследование культур с помощью ПБДЭ согласно инструкции (приложение 1).

Спустя 24ч инкубации пластин при температуре 37 °С был произведен учет полученных результатов. Идентификацию культур микроорганизмов осуществляли с использованием таблицы биохимических свойств энтеробактерий, диагностического «ключа», каталога кодов. При этом было установлено, что две культуры из воды исследуемого водоема относятся к семейству энтеробактерий, это культуры № 7 и №15. культура №7 по полученным данным биохимического теста относится к Providencia stuartii, а культура №15, предположительно относится к виду Providencia alcalifaciens.

В результате проделанной работы все полученные данные по численности и по родовому разнообразию были объединены в сводные таблицы 5 и 6.

 

Таблица 5

Численность групп водных микроорганизмов оз. Мраморное.

Группа микроорганизмов	Количество микроорганизмов в воде оз.Мраморное, КОЕ/мл	Количество микроорганизмов в воде микроэкосистемы оз.Мраморное, КОЕ/мл
Сапрофиты	1,9*104	9,3*104
Олиготрофы	50	1,3*102
Плесневые грибы	120	2,3*103
Дрожжи	3,3*102	­-

 

Таблица 6

Родовой состав групп водных микроорганизмов оз. Мраморное

Группа микроорганизмов	Рода микроорганизмов в воде оз.Мраморное	Рода микроорганизмов в воде микроэкосистемы оз.Мраморное
Сапрофиты	Pseudomonas Providencia Bacillus Halococcus, Haloferax Halobacterium Streptococcus	Pseudomonas Providencia Bacillus Micrococcus
Олиготрофы	Halobacterium Pseudomonas Micrococcus Bacillus	Halobacterium
Плесневые грибы	Aspergillus Acr е monium	Aspergillus Acremonium  Alternaria

Выводы

 

1. Из воды озера Мраморное выделены микроорганизмы различных трофических групп, определенна их численность. Выделенные микроорганизмы являются галофильными, так как растут на средах, приготовленных на основе воды оз.Мраморное, которая характеризуется повышенной минерализацией.

2. В состав выделенных микроорганизмов оз. Мраморное входят сапрофитные и олиготрофные бактерии родов Halobacterium , Pseudomonas , Providencia , Micrococcus , Bacillus , Halococcus , Haloferax , Streptococcus , также в воде данного озера часто встречаются плесневые грибы родов Aspergillus , Acr е monium . Alternaria .

Литература

 

1. Агре Н.С. Археобактерии. – Пущино, 1988.- С.241

2. Алабышев В.В. Зональность озерных отложений. – 1932, Вып. 6. - С. 1-44.

3. Богданова Л.Л. Химический состав атмосферных осадков Забайкалья // в кн.: Геохимия и гидрохимия природных вод восточной Сибири. – Иркутск, 1973.-С. 207-214.

4. Бонч-Осмоловская Е.А., Заварзин Г.А., Герасименко Л.М., Венецкая С.Л. Исследование терминальных процессов анаэробной деструкции нагонных масс кладофоры в озере Сиваш //Микробиология. – 1988, Т. 57, Вып. 2. - 312 с.

5. Брянцева И.А. Аноксигенные фототрофные бактерии содовых озер Юго-Восточного Забайкалья. Автореферат на соискание ученой степени канд. биол. наук. - Москва. – 2000, С. 5 - 22.

6. Бульон В.В. Первичная продукция планктона внутренних водоемов. -Ленинград: "Наука" ЛО, 1983, 148с.

7. Власов Н.А., Филиппова Г.Р. Физико-химическая характеристика минеральных озер Юго-Восточного Забайкалья // в кн.: Геохимия и гидрохимия природных вод восточной Сибири. – Иркутск, 1973, С. 3-57.

8. Герасименко Л.М., Дубинин А.В., Заварзин Г.А. Алкалофильные цианобактерии содовых озер Тувы и их экофизиология // Микробиология, 1996, Т.65, №6, С.844-849.

9. Герасименко Л.М., Заварзин Г.А. Реликтовые цианобактериальные сообщества // в кн.: Проблемы доантропогенной эволюции биосферы / Отв. ред. д. г. м. н. А. Ю. Розанов. - М.: Наука, 1993, С.222-254

10. Гончиков Г.Г., Намсараев Б.Б. Экстремофилы как клеточные фабрики: молекулярная эволюция, экология, биотехнологические перспективы // журн. Инженерная экология. -2000, №1, С.3-13.

11. Горленко В.М. Намсараев Б.Б., Кулырова А.В., Заварзина Д.Г., Жилина Т.Н. активность сульфатредуцирующих бактерий в донных осадках содовых озер Юго-Восточного Забайкалья // Микробиология, 1999,- Т, 68, №5, С.664-670.

12. Громов Б.В., Павленко Г.В. Экология бактерий. - Л.: Изд-во ЛГУ, 1989, С. 102-104.

13. Гусев М.В., Минеева Л.А. Микробиология.-М.: Изд-во «Академия», 2003, С. 417-423.

14. Дзюба А.А., Тулохонов А.К., Абидуева Т.И., Гребнева П И. Распространение и химизм соленых озер Прибайкалья и Забайкалья // журн. География и природные ресурсы, 1997, №4, С. 65-71.

15. Дубинин А.В., Герасименко Л.М., Заварзин Г.А. Экофизиология и видовое разнообразие цианобактерий содового озера Магади // Микробиология, 1995, Т, 64, С.845-849.

16. Жилина Т.Н., Заварзин Г.А. Новая экстремально-галофильная гомоацетатная бактерия Acetohalobium arabaticum gen. nov., sp. nov. // Докл. ЛН СССР. 1990, Т. 311, С. 745-747.

17. Жилина Т.Н., Гарнова Е.С., Турова Т.П., Кострикина Н.А., Заварзин Г.А. Amphibacillus fermentum sp. nov., Amphibacillus tropicus sp. nov. - новые алкалофильные и факультативно-анаэробные сахаролитические бациллы из озера Магади. // Микробиология, 2001, Т.70, №6, С. 825 - 837.

18. Жилина Т.Н., Гарнова Е.С., Турова Т.П., Кострикина Н.А., Заварзин Г.А. Halonatronum saccharophilum gen. nov. sp. nov. - новая галоалкалофильгая бактерия порядка Haloanaerobiales из озера Магади. // Микробиология, 2001, Т.70, №1, С. 77-85.

19. Заварзин Г.А. Развитие микробных сообществ в истории Земли // в кн.: Проблемы доантропогенной эволюции биосферы. - М.: Наука, 1993, С. 206-220.

20. Заварзин Г.А., Жилина Т.Н., Пикута Е.В. Вторичные анаэробы в галоалкалофильных сообществах озер Тувы // Микробиология, 1996, Т. 65, №4, С. 546-553.

21. Заварзин Г.А., Жилина Т.А., Кевбрии В.В. Алкалофильное микробное сообщество и его функциональное разнообразие // Микробиология, 1999, Т. 68. №3, С. 579-599.

22. Заварзин Г.А., Жилина Т.Н. Содовые озера природная модель древней биосферы континентов //Природа, 2000, №2, С. 45-55.

23. Калюжная М.Г., Хмеленина В.Н., Сузина., Лысенко A.M., Троценко Ю.А. Новые метанотрофные изоляты из щелочных озер Южного Забайкалья. .// Микробиология, 1999, Т.68, №5, С. 677 - 685.

24. Кевбрин В.В., Жилина Т.Н., Заварзин Г.А. Разложение целлюлозы алкалофильным анаэробным сообществом // Микробиология, 1999, Т.68, №5, С.686-695.

25. Крамаренко Л.Е. Геохимическое и поисковое значение микроорганизмов подземных вод. -Л.: Недра, 1983, С. 85 - 124.

26. Кузнецов Н.Т., Мурзаев Э.М. Озерные стадии развития Центральной Азии в четверичное время. Озера полуаридной зоны. - М.: Изд-во АН СССР, 1963, С. 82-88.

27. Кузнецов СИ. Микрофлора озер и ее геохимическая деятельность - Л.: Наука, 1970, С.21-50.

28. Кулырова А.В. Влияние условий среды обитания на распространение и активность микроорганизмов содовых озер Южного Забайкалья. Автореферат на соискание ученой степени канд. биол. наук. - Улан-Удэ, 1999, С. 5-11.

29. Летунова СВ., Ковальский В.В. Геохимическая экология микроорганизмов.-М.: Наука, 1978, С 147- 152.

30. Ляликова Н.Н. Роль микроорганизмов в образовании и разрушении сульфидов в рудных месторождениях. - Геология рудн. минералов, 1970, № 1, С. 63-73.

31. Мишустин Е.Н., Емцев В.Т. Микробиология.-М.: Агропромиздат, 1987, С 368.

32. Намсараев Б.Б., Жилина Т.Н., Кулырова А.В., Горленко В.М. Бактериальное образование метана в содовых озерах Юго-Восточного Забайкалья // Микробиология, 1999, Т.68, №5, С.664-670.

33. Намсараев Б.Б. Функциональная роль микробных сообществ экстремальных водных экосистем байкальской рифтовой зоны // Материалы Всероссийской конференции. Биоразнообразие и функционирование микробных сообществ водных и наземных систем Центральной Азии. - Улан-Удэ: Изд-во БГСХА, 2003, С.99-101.

34. Перфильев Б.В., Габе Д.Р. Изучение методом микробного пейзажа бактерий, накопляющих марганец и железо в донных отложениях / Роль микроорганизмов в образовании железо-марганцовых озерных руд. - М.: Наука, 1964, С.59-82.

35. Пикута Е.В., Лысенко A.M., Жилина Т.Н. Распространение Desulfonatronovibrio hydrogenovorans в содовых озерах Тувы // Микробиология. – 1997, Т.66, С. 262 - 268.

36. Практикум по микробиологии. Под ред. Н.С.Егорова, МГУ.- 1976. - С.61-65

37. Пристл Ф. Внеклеточные ферменты микроорганизмов- М.: Мир, 1987, 115с.

38. Романенко В.И. Микробиологические процессы продукции и деструкции органического вещества во внутренних водоемах. - М.: Наука, 1985, С. 293-295.

39. Самарина B.C. Гидрогеохимия.- Л.:ЛГУ, 1977, С.285-324.

40. Симанькова М.В., Ножевникова А.Н. Термофильное гомоацетатное сбраживание целлюлозы комбинированной культурой Clostridium thermocellum и Clostridium thermoautotrophicum // Микробиология, 1989, Т. 58, С. 897 -902.

41. Сорокин Д.Ю., Лысенко A.M., Митюшина Л.Л. выделение и характеристика алкалофильных хемоорганотрофных бактерий, окисляющих восстановленные неорганические серные соединения до тетратионата // Микробиология, 1996. Т.65, С.370 - 383.

42. Стрижова Т.А., Орлик Л.А. Гидрохимический режим озера // Содовые озера Забайкалья: экология и продуктивность, Новосибирск. Наука, 1991, С. 19-80.

43. Тополов А.А. Донное газообразование в озерах Забайкалья / Отв. ред. канд. биол. наук Парфенова В.В. - Новосибирск.- Наука, 1991, С.44-50.

44. Троценко Ю.А., Хмеленина В.Н. Особенности биологии галоалкалофильных метанотрофов. // Микробиология, 2002, Т. 71, №2, С. 149-159.

45. Франк-Каменецкий А.Г. Гуджирные озера Восточно-Сибирского края // За индустриализацию Советского Востока, 1932, №2, С. 25-34.

46. Шлегель Г. Общая микробиология, М.: Мир, 1987, С. 556 - 559.

47. Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology, Baltimore; Hong Kong; London; Sydney, 1984, 1986, 1989. Vol. 1-4.

48. Gorlenko V.M., Bryantseva I.A. & Kompantseva E.I. Novel alkaliphilic heliobacteria from southeast Siberia soda lakes environments. In: Abstracts of the Workshop on "Green and Heliobacteria", Urbino, Italy, 1997 - p.6.

ПРИЛОЖЕНИЕ

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

НАУЧНО-ПРОИЗВОДСТВЕННОЕ ОБЪЕДИНЕНИЕ

ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ СИСТЕМНЫ

ИНСТРУКЦИЯ

по применению пластины биохимической, дифференцирующей энтеробактерии «П Б Д Э»

ПБДЭ - система одноразового использования для дифференциации микроорганизмов семейства энтеробактерии.

ПБДЭ позволяет определить следующие биохимические свойства: утилизацию цитрата натрия, как в присутствии сахара (модификация цитратной среды Христенсена), так и без него (модификация цитратной среды Симмонса), малоната натрия, глюкозы лактозы, маннита, сахарозы, инозита, сорбита, арабинозы, мальтозы, образование индола сероводорода, ацетилметилкарбинола (реакция Фогес-Проскауэра), наличие уреазы, β-галактозидазы, декарбоксилаз орнитина и лизина, дегидролазы аргинина, дезаминазы фенилаланина.

ПБДЭ представляет собой панель с 20 конусообразными лунками, на дно которых нанесены соответствующие субстраты с индикатором, стабилизированные поливиниловым спиртом. Панель закрывается крышкой Панель и крышка изготовлены из полистирола.

Субстраты с индикаторами вносят в лунки в жидком виде, затем высушивают и стерилизуют.

Биологические свойства. Специфическое действие препарата заключается в возможности дифференцировать энтеробактерии на основе определения ферментативных систем по их действию на соответствующие субстраты.

Назначение. Пластина биохимическая -дифференцирующая, энтеробаетери предназначена, для определения ферментативной активности микроорганизмов семейства Еnterobacteriaceae, выделяемых в ходе бактериологического исследования, и идентификации представителей данного семейства до вида.

Способ применения

1. Приготовление растворов

Фосфатно-буферный раствор (ФБР) рН 6.0-6,2 - для приготовления суспензии исследуемых образцов. Содержимое флакона с сухими компонентами ФБР растворяют в 100,0 мл дистиллированной воды.

Стерилизуют автоклавированием 30 мин при 0,5 атм, концентрацию водородных ионов рН контролируют на иономере универсальном.

Хлорид железа - для выявления наличия фенилаланиндезаминазы. Содержимое флакона растворяют в 1,8 мл дистиллированной воды

Парадиметиламинобензальдегид - для обнаружения индолообразования. Для приготовления реактива Эрлиха навеску растворяют в 1,9 мл 96% этилового спирта, а затем добавляют 0,4 мл 33% соляной кислоты

α-нафтол - для обнаружения образования ацетилметилкарбинола. Содержимое флакона растворяют в 2,38 мл 96% этилового спирта. Готовят ех tеmроrе.

Калия гидроокись - для обнаружения образования ацетилметилкарбинола. Содержимое флакона растворяют в 1,2 мл дистиллированной воды.

2. Подготовка исследуемых образцов

Перед проведением исследования выделенная культура подлежит изучению на чистоту и принадлежность к семейству Еnterobacteriaceae.

Идентификацию культур, выделяемых непосредственно из нативного материала, производят со скошенного мясо-пептонного агара или со среды Олькеницкого. Используют культуры, выращенные в течение 18-24 ч при температуре 37°С, без предварительного подращивания их на мясо-пептонном бульоне.

Если выделенная культура микроорганизма находилась какое-либо время на хранении при комнатной температуре или в холодильнике, производят предварительный посев ее на мясо-пептонный бульон на 2-4 ч при. Температуре 37°С, затем осуществляют пересев культуры на скошенный мясо-пептонный агар. Посевы инкубируют в течение 18-24 ч при температуре 37 °С.

Культуру с мясо-пептонного агара или среды Олькеницкого используют для приготовления суспензии в фосфатно-солевом буферном растворе рН 6,0-6,2 и доводят мутность суспензии до 10 единиц по отраслевому стандартному образцу мутности бактерийных взвесей, стеклянному.

При отсутствии отраслевого стандартного образца в 4,0 мл стерильного фосфатно-солевого буферного раствора вносят исследуемую (2-3 петли) культуру до образования видимой мутности.

Проведение исследования

1. Вскрывают упаковку.

2. Регистрируют на крышке панели номер засеваемого штамма.

3. Открывают крышку и располагают панель на столе.

4. Добавляют пипеткой по 0,15 мл микробной суспензии во все лунки панели, кроме лунки для

обнаружения сероводорода (№ 11), куда вносят только одну каплю (0,05 мл) суспензии.

5. Заливают лунку для обнаружения сероводорода (№ 11) 0,1 мл растопленного и охлажденного до температуры (38-40) °С мясо-пептонного агара, содержащего 0,6% агара микробиологического, и быстро все перемешивают концом раскапывающей пипетки.

6. Для создания анаэробных условий добавляют 1-2 капли стерильного вазелинового масла в лунки для определения лизиндекарбоксилазы (№ 4), аргининдегидролазы (№ 5), орнитиндекарбоксилазы (№ 6), уреазы (№ 10) и образования сероводорода (№ 11)

7. Закрывают крышку панели.

8. Выдерживают ПБДЭ в течение 18-24 ч при температуре 37 °С.

Учет результатов. Учет результатов производят визуально в соответствии с цветовым указателем, приложенным к ПБДЭ, через 18-24 ч инкубации при температуре 37 °С, за исключением теста на обнаружение β-галактозидазы, который проводят дважды: через 3-5 ч и через 18-24 ч, т.к. у некоторых штаммов лимонно-желтое окрашивание через 18-24 ч исчезает.

Через 18-24 ч инкубации открывают крышку панели и в лунку для выявления фенилаланиндезаминазы (№ 7) добавляют 1 каплю 10 %-го раствора хлорида железа (железо треххлористое 6-водное), в лунку для определения ацетилметилкарбинола (№ 9) 1 каплю 6%-го раствора а-нафтола и затем 1 каплю 40%-го раствора гидроокиси калия, в лунку для выявления индола (№ 8) - 1-3 капли реактива Эрлиха. Реакции учитывают немедленно, выявление ацетилметилкарбинола осуществляют через 15-20 мин после закапывания реактивов.

Идентификацию культур микроорганизмов осуществляют с использованием таблицы биохимических свойств энтеробактерий, диагностического «ключа», каталога кодов - пособия для интерпретации результатов идентификации с использованием математического метода классификации.

 

Цветовой указатель

	Тесты	Цвет среды в  растворенном виде	Положительная реакция	Отрицательная реакция
1	Утилизация цитрата натрия	желтый, светло-зеленый	темно-зеленый, синий	желтый, светло-зеленый
2	Утилизация малоната натрия	желтый	темно-зеленый, синий	желтый, светло-зеленый
3	Утилизация цитрата натрия с глюкозой	желтый коричневый	фиолетовый, бурый	желтый, коричневый
4	Наличие лизиндекарбоксилазы	желтый, светло-зеленый	темно-зеленый, синий	желтый, светло-зеленый
5	Наличие аргининдегидролазы	Желтый, светло-зеленый	темно-зеленый, синий	желтый, светло-зеленый
6	Утилизация орнитиндекарбоксилазы	Желтый, светло-зеленый	темно-зеленый, синий	желтый, светло-зеленый
7	Наличие фенилаланиндезаминазы	бесцветный	темно-зеленый	желтый
8	Образование индола	бесцветный	розовый	бесцветный
9	Образование ацетилметилкарбинола	бесцветный	розовый, малиновый	бесцветный
10	Наличие уреазы	желтый	малиновый, красный	желтый
11	Образование сероводорода	бесцветный	черный, темно-серый	желтый
12	Утилизация глюкозы	красный	желтый	красный
13	Наличие β-галактозидазы	бесцветный	лимонно-желтый	бесцветный
14	Утилизация лактозы	красный	желтый	красный
15	Утилизация маннита	красный	желтый	красный
16	Утилизация сахарозы	красный	желтый	красный
17	Утилизация инозита	красный	желтый	красный
18	Утилизация сорбита	красный	желтый	красный
19	Утилизация арабинозы	красный	желтый	красный
20	Утилизация мальтозы	красный	желтый	красный

 

Обезвреживание ПБДЭ Погружением (полным) на 60 мин в 3% раствор хлорамина Б или 6% раствор перекиси водорода с 0,5% СМС.

Форма выпуска. Выпускается в наборе, состоящем из 20 пластин в герметично запаянном пакете, 1 флакона с 0,95 г сухих компонентов ФБР рН 6,0-6,2, 1 флакона с 0,2 г хлорида железа (III), 1 флакона с 0,02 г парадиметиламинобензальдегида. 1 флакона с 0,8 г калия гидроокиси, 1 флакона с 6,12 г а-нафтола, 1 флакона с 8,0 г масла вазелинового, инструкции по применению, диагностического «ключа», таблицы биохимических свойств энтеробактерий и 20 штук кодовых карточек. Набор тест-системы упакован в коробку. По просьбе потребителей к набору может быть дополнительно приложен каталог кодов.

Условия хранения и транспортирования. Транспортирование и хранение препарата в защищенном от света месте при температуре от 2 до 25^○С.

Срок годности 1 год.