Метод определения уровня гамма-интерферона в сыворотке крови
Для определения уровня гамма-интерферона использовался метод твердофазного иммуноферментного анализа‚ с использованием набора реактивов "ИФА-IFN-gamma" фирмы ВЕКТОР-БЕСТ. Набор "ИФА-IFN-gamma" предназначен для определения концентрации γИФН в сыворотке крови в клинических, диагностических и научно-исследовательских лабораториях. Состав набора: ■ комплект из двенадцати восьмилуночных стрипов с рамкой с иммобилизованными на внутренней поверхности лунок моноклональными антителами к интерлейкину-4, маркирован "Стрипы с моноклональными антителами"; ■ 7 калибровочных проб, содержащих известные количества гамма-интерферона – 0; 50; 100; 300; 500; 1000 и 2000пг\мл, лиофилизованные препараты; ■ аналитический буферный раствор, маркирован "Буфер А", 1 флакон; ■ концентрированный раствор антител IFN-gamma-биотин, маркирован "Антитела", 1 флакон; ■ концентрированный раствор конъюгата авидин-пероксидаза, маркирован "Конъюгат Е", 1 флакон; ■ концентрированный буферный раствор для промывок лунок, маркирован "Буфер Р", 1 флакон; ■ субстратный буфер, маркирован "Буфер С", 1 флакон; ■ 10% кислота, маркирована "Стоп-реагент", 1 флакон; ■ раствор тетраметилбензидина, маркирован " ТМБ"; Дополнительные материалы и оборудование: ■ автоматические одноканальные пипетки с изменяемым объемом отбора жидкостей: от 0,005 до 0,01 мл; от 0,05 до 0,25 мл; от 0,2 до 1 мл; от 1 до 5 мл; ■ одноканальная полуавтоматическая пипетка, позволяющая отбирать объемы жидкости до 0,3 мл. ■ прибор для встряхивания рамки со стрипами (шейкер), позволяющий производить встряхивание с амплитудой колебания 3-4мм и частотой 4-6 Гц при комнатной температуре (+16-25°С), либо статируемый шейкер, позволяющий производить встряхивание в том же режиме при температуре +37°С; ■ спектрофотометр, позволяющий измерить оптическую плотность раствора в стрипах при длине волны 450нм; ■ цилиндры, позволяющие отмерять 10 и 100 мл; ■ два стеклянных стакана емкостью 20 мл и один - 150 мл; ■ дистиллированная вода. Принцип работы набора. В наборе "ИФА-IFN-gamma " использован "сэндвич" вариант твердофазного иммуноферментного анализа. Для реализации этого варианта использованы два моноклональных антитела с различной эпитопной специфичностью к гамма-интерферону. Одно из них иммобилизовано на твердой фазе (внутренняя поверхность лунок), второе конъюгировано с биотином. На первой стадии анализа γИФН, содержащийся в калибровочных и исследуемых пробах связывается с антителами, иммобилизованными на внутренней поверхности лунок. На второй стадии анализа иммобилизованный γИФН взаимодействует с конъюгатом вторых антител – биотин. Количество связавшегося конъюгата прямо пропорционально количеству γИФН в исследуемом образце. На последней стадии анализа в лунки вносят авидин-пероксидазу. Во время инкубации с субстратной смесью происходит окрашивание раствора в лунках. Степень окраски прямо пропорциональна количеству связавшихся меченых антител. После измерения оптической плотности раствора в лунках на основании калибровочной кривой рассчитывается концентрация γИФН в определяемых образцах. Подготовка реагентов к анализу · Калибровочные пробы. Во флаконы с калибровочными пробами добавить по 1,0 мл дистиллированной воды, выдержать в течение 20мин. И затем тщательно перемешать до полного растворения, избегая пенообразования. Хранить при температуре +4...6° С в течение трех суток; при возможности более длительного хранения разлить по 220 мкл (чтобы избежать повторного оседания) и хранить при температуре -20° С не более месяца. · Стрипы. Вскрыть и установить на рамку необходимое количество стрипов. Оставшиеся стрипы хранить в герметично закрытом пакете из фольгированного полиэтилена при температуре · Сывороточный буфер. В стакан с 480 мл дистиллированной воды добавить содержимое флакона с маркировкой"Буфер Р". Тщательно перемешать, избегая пенообразования. Xранить промывочный буфер при температуре +2…8°С. · Буфер А. Готов к использованию. Хранить закрытым при температуре +2…6° С. · Набор антител анти- γИФН-биотин. В зависимости от количества используемых стрипов подготовить необходимый объем однократного раствора антител путем смешивания 40 мкл концентрированного антител с 1 мл промывочного буфера из расчета на один стрип. Однократный раствор антител должен быть использован в течение часа, длительному хрипению не подлежит. · Конъюгат Е. авидин-пероксидаза. В зависимости от количества используемых стрипов подготовить необходимый объем однократного раствора конъюгата путем смешивания 40 мкл концентрированного конъюгата Е с 1 мл промывочного буфера из расчета на один стрип. Однократный раствор конъюгата Е должен быть использован в течение часа, длительному хранению не подлежит. · Субстратная смесь приготовляется непосредственно перед употреблением. · "Стоп-реагент" готов к использованию. Проведение анализа:
Таблица 3. Расход реагентов для проведения анализа
Пример калибровочных кривых для каждого конкретного набора приводиться в Паспорте контроля качества (Рис. Б). Рис. 7. Калибровочная кривая (ОБРАЗЕЦ) для определения γИФН
Популярное: Генезис конфликтологии как науки в древней Греции: Для уяснения предыстории конфликтологии существенное значение имеет обращение к античной... Почему люди поддаются рекламе?: Только не надо искать ответы в качестве или количестве рекламы... ©2015-2024 megaobuchalka.ru Все материалы представленные на сайте исключительно с целью ознакомления читателями и не преследуют коммерческих целей или нарушение авторских прав. (243)
|
Почему 1285321 студент выбрали МегаОбучалку... Система поиска информации Мобильная версия сайта Удобная навигация Нет шокирующей рекламы |