Задание 24. Химические и оптические свойства пигментов листа

В процессе фотосинтеза высших растений участвуют две группы пигментов: зеленые - хлорофиллы а и b и желтые - каротины и ксантофиллы. Работа знакомит с методом выделения пигментов, разделения по методу Крауса, с основными химическими и оптическими их свойствами. Вся работа состоит из отдельных этапов, которые выполняют в приведенной ниже последовательности.

1. Получение спиртового раствора пигментов.

С этой целью можно использовать сухие листья и свежий растительный материал. При работе с последним удобны листья герани.

Ход работы. 1-2 листа герани поместить в фарфоровую ступку, добавить немного битого стекла для лучшего измельчения растительных тканей и щепотку мела для создания нейтральной или слабощелочной реакции в среде. Листья растереть до однородной массы, в которую добавить 10-15 мл этанола. После тщательного перемешивания гомогенат отфильтровать в пробирку через бумажный фильтр с белой лентой. Чтобы жидкость при выливании из ступки не бежала по стенке, приставить стеклянную палочку к носику ступки, смазанному снаружи вазелином. Ступку и пестик можно ополоснуть несколькими миллилитрами этанола, который надо сливать на этот же фильтр. Так как работа носит качественный характер, можно не добиваться полного переноса пигментов в раствор. Если первые порции фильтрата получились мутными, их снова надо профильтровать, не меняя фильтра. Полученный экстракт зеленого цвета может быть использован для последующих опытов.

2. Разделение пигментов по методу Крауса.

Метод основан на различной растворимости пигментов в спирте и бензине, которые при сливании не смешиваются, образуя два слоя: верхний - бензин, нижний – спирт. Эмпирическая формула хлорофилла a - С₅₅ Н₇₂ О₅ N₄ Mg, хлорофилла b - С₅₅ Н₇₀ О₆ N₄ Mg. Хлорофилл является сложным  эфиром дикарбоновой кислоты хлорофиллина и двух спиртов - метанола и фитола. Фитол имеет длинную углеводородную цепочку (С₂₀ Н₃₉), которая и определяет гидрофобность молекулы хлорофилла. Он лучше растворяется в гидрофобном растворителе-бензине. Каротин, будучи углеводородом (С₄₀ Н₅₆), также гидрофобен и имеет большое сродство с бензином. Ксантофиллы - спирты (С₄₀ Н₅₆ О₂), и поэтому они лучше растворяются в этаноле, чем в бензине.

Ход работы. В пробирку налить 2-3 мл спиртовой вытяжки пигментов и добавить 3-4 мл бензина (вместо бензина можно использовать петролейный эфир). Пробирку встряхнуть и дать отстояться. Происходит отслоение эмульсии. Сверху собирается бензин с перешедшими в него хлорофиллами, которые и окрашивают данный слой в зеленый цвет. Каротин также находится в бензине, но он маскируется хлорофиллом. Нижний спиртовой слой содержит пигмент ксантофилл и окрашен в желтый цвет.

Если разделение пигментов происходит нечетко, то в пробирку надо добавить 1-2 капли воды и снова сильно встряхнуть. Избытка воды следует избегать, так как может произойти помутнение раствора.

В конце работы зарисовать картину разделения пигментов и дать объяснение различной растворимости пигментов в спирте и бензине.

3. Омыление хлорофилла щёлочью.

К реакции омыления способны сложные эфиры, при этом их молекула под влиянием воды или щелочи расщепляется на кислоту и спирт. Из пигментов листа омыляется только хлорофилл, от молекулы которого под влиянием щелочи отщепляются метанол и фитол:

Образующаяся при омылении натриевая соль хлорофиллиновой кислоты сохраняет зеленую окраску, но приобретает гидрофильные свойства, а значит, и большее сродство со спиртом. Желтые пигменты при действии щелочи не изменяют своей химической природы.

Ход работы. В пробирку с 2-3 мл вытяжки пигментов добавить 1-2 капли 20%-го раствора щелочи NaОН. Пробирку нагреть на водяной бане до закипания в ней раствора. После охлаждения добавить в пробирку 2-3 мл бензина и 2-3 капли воды для лучшего разделения смеси. Затем содержимое пробирки сильно встряхнуть и дать отстояться. Вновь наблюдаются два слоя, зеленым окрашен нижний, спиртовой, так как в нем растворена натриевая соль хлорофиллиновой кислоты. Там же располагаются ксантофиллы, но они замаскированы более темной зеленой окраской. В бензине остался свободный каротин, который и определяет желтый цвет верхнего слоя.

В конце работы зарисовать картину разделения пигментов после омыления хлорофилла, дать объяснение наблюдаемого.

4. Получение феофитина и обратное замещение водорода атомом металла.

Хлорофилл относится к Mg-порфиринам. Главной частью его молекулы является порфириновое ядро, состоящее из четырех пиррольных колец. Их вершины с атомами азота направлены к центру порфиринового ядра и взаимодействуют с атомом магния, занимающим центральное положение. Но магний в порфириновом ядре удерживается непрочно и при осторожном воздействии сильных кислот может быть замещен на два атома водорода. Водородзамещенный хлорофилл называется феофитином и имеет бурый цвет.

Водород феофитина можно заменить снова металлом, если подействовать солями меди и цинка, при этом восстанавливается зеленая окраска пигмента. Следовательно, цвет хлорофилла зависит от наличия металлоорганической связи в молекуле.

Процесс феофетинизации часто наблюдается в природе и свидетельствует об увеличении проницаемости живых мембран, а значит, о повреждении и гибели клеток.

Ход работы. В две пробирки налить по 2-3 мл спиртового раствора пигментов и прибавить по одной-две капли 10%-й соляной кислоты. Зеленая окраска раствора переходит в бурую, так как образовался феофитин. Одну пробирку оставить для контроля, во вторую внести небольшой кристаллик уксусной меди и нагреть раствор на водяной бане до кипения. Бурый цвет раствора изменится на зеленый, так как произошло образование хлоро­илл-производного меди:

В конце работы зарисовать обе пробирки и дать о6ъяснение причины различной окраски их содержимого.

5. Спектр поглощения пигментов.

Пигменты листа поглощают свет в пределах видимой части спектра от 400 до 700 нм, получившей название фотосинтетически активной радиации (ФАР). Отдельные пигменты обладают избирательностью поглощения участков спектра. Для спектра хлорофиллов характерно наличие двух максимумов поглощения: в красной и сине-фиолетовой области. Желтые пигменты поглощают свет только в области сине-фиолетовых лучей.

Ход работы. Для определения спектра поглощения пигментов используется спектроскоп. Этот прибор имеет различные модификации в устройстве, но общий принцип работы. Луч света попадает на призму, разлагающую его на составные цвета, которые и видны в окуляр прибора. Если на пути светового потока поместить какой-либо раствор, то в зависимости от оптических свойств растворенного вещества отдельные участки спектра будут поглощаться, что проявится в возникновении темных полос в видимом спектре.

Для наблюдения спектра поглощения зеленых пигментов к щели спектроскопа, через которую попадает свет на призму, поднести пробирку со спиртовым раствором хлорофиллов. Концентрация раствора не должна быть высокой, иначе все лучи будут поглощаться. Очень концентрированные растворы нужно разбавить в 2-3 раза и более.

Для наблюдения спектров поглощения каротина и ксантофиллов к щели прибора поднести пробирку, имеющую желтый бензиновый слой, содержащий каротин, или желтый спиртовой слой, в котором растворен ксантофилл.

В конце работы зарисовать спектр белого света и спектры поглощения хлорофиллов, каротина и ксантофиллов.

6. Флуоресценция хлорофилла.

Свойство флуоресценции характерно для хлорофилла. Оно состоит в том, что под влиянием кванта света один π-электрон молекулы хлорофилла переходит на более высокий энергетический уровень, то есть молекула возбуждается. Это состояние недолговечно, и электрон вновь возвращается на первоначальный уровень, происходит излучение. Хлорофилл флуоресцирует в красной части спектра. Более сильная флуоресценция наблюдается ухлорофилла в растворах, в листьях она очень слаба.

Ход работы. Пробирку с раствором хлорофилла рассмотреть в отраженном свете, при этом цвет раствора кажется темно-красным, бурым, коричневым. В конце работы описать явление флуоресценции.

По окончании всех этапов работы перечислить изученные химические и оптические свойства зеленых и желтых пигментов.