АНТИОКСИДАНТНЫЕ СВОЙСТВА ДИГИДРОКВЕРЦЕТИНА

Первым этапом наших исследований было изучение антиоксидантных свойств дигидрокверцетина. Антиоксидантная активность (АОА) определяется различными методами, в том числе наиболее часто для этой цели используют модельную систему: люминол-H₂O₂-катализатор, где в качестве катализатора могут выступать пероксидаза, гемоглобин или соли металлов переменной валентности. Под антиоксидантными свойствами соединения подразумевают его антиокислительную (АОА) и антирадикальную активности (АРА). Антиокислительная активность определяется различными методами, в том числе наиболее часто для этой цели используют модельную систему: люминол-H₂O₂-катализатор, где в качестве катализатора могут выступать пероксидаза, гемоглобин или соли металлов переменной валентности. В данной работе определяли АОА и АРА ингибиторов свободнорадикальных реакций в модельной биохимической системе, содержащей люминол, пероксидазу хрена и пероксид водорода.

Рис.6 Типичные кривые интенсивности хемилюминесцентного ответа в модельной системе в зависимости от концентрации дигидрокверцетина (введение антиоксиданта до начала реакции).

Если рассмотреть модельную систему с точки зрения образования РФК, понятно, что в начальный период основной формой окислителя является перекись водорода, вследствие чего добавка антиоксиданта в начале ХЛ-ответа позволяет судить нам о его антиокислительных свойствах.

С другой стороны достижение равновесия, визуально наблюдаемого в максимуме хемилюминесценции, сопровождается взаимодействием антиоксиданта как с молекулярной формой (H₂O₂), так и наиболее предпочтительнее с его радикальными формами, позволяя судить об антирадикальных свойствах.

Рис.7 Типичные кривые изменения уровня РФК в максимуме хемилюминесценции при добавлении дигидрокверцетина.

Антиоксидантные свойства флавоноидов (в том числе и для ДГК) напрямую зависят от их липофильных свойств, т.е. с уменьшением молекуляной массы увеличивается их АРА. Тем не менее, не только это является основополагающим для данной группы антиоксидантов. Такие производные, как пентаацетат ДГК и пентабензоат ДГК обладают слабой активностью, вследствие отсутствия свободных группировок, и единственно возможным путем реагирования со свободными радикалами может быть присоединение радикала по карбоксильной группе с образованием метастабильных радикалов орто-кислот, с дальнейшим отщеплением эфирной группировки (Шаталин Ю.В., и др. 2008). Альтернативный механизм реакции с подобными антиоксидантами является гидролитическое расщепление антиоксиданта до исходных компонентов и дальнейшая реакция их с радикальными формами. Второй путь является известным явлением, характерным для расщепления производных флавноноидов и эфиров полифенольных соединений в организме животных. Подобное расщепление выполняется рядом арилэстераз, присутствующих и в плазме крови. Но в модельных системах данный процесс маловероятен.

В качестве другой модельной системы была выбрана система, где в качестве источника генерации АФК были использованы полиморфноядерные лейкоциты (ПМЯЛ) здорового животного и опухоленосителя, которые в ответ на стимул (ФМА) способны продуцировать супероксид-анион с последующим молекулярным превращением его в другие активные формы кислорода. Такой подход позволяет оценить действие антиоксидантов на респираторный взрыв фагоцитов. В системе данного типа происходит взаимодействие антиоксидантов с радикальными формами кислорода.

В данной системе наблюдалось снижение чувствительности системы к возрастающему количеству антиоксиданта, что связано с насыщенностью им водной фазы и накоплением в липидном слое клеточной мембраны и что проявляется в расхождении между значениями между антиоксилительной активностью и антирадикальной активностью флавоноида на 2 порядка. Благодаря постоянной диффузии между двумя фазами и по мере окисления антиоксиданта в растворе, происходит обмен окисленных форм антиоксиданта на восстановленные из липидной фазы.

Скорость взаимодействия с АФК лимитируется только диффузионной составляющей. Для гидрофильных антиоксидантов (гипоксен и аскорбиновая кислота) такого эффекта не наблюдается, и сужение разностной гистограммы наблюдается только при 95% ингибировании хемилюминесценции (Шаталин Ю.В., и др. 2008).

 В результате исследований было обнаружено, что концентрация антиоксиданта, необходимая для снижения ХЛ-ответа в клеточной системе, на порядок больше, чем в модельной биохимической системе. При действии гидрофобного антиоксиданта на клетки, происходит частичное распределение его в липидной компоненте мембраны, тем самым увеличивается концентрация антиоксиданта, требуемая для снижения АФК в водной фазе.

Рис.8 Типичные кривые изменения уровня РФК в максимуме хемилюминесценции в системе, содержащей фагоцитирующие клетки кровеносного русла здорового животного, при добавлении различных концентраций дигидрокверцетина (АРА).

Рис.9 Типичные кривые хемилюминесценции в системе, содержащей фагоцитирующие клетки здорового животного, при добавлении дигидрокверцетина.

Основные реакции, протекающие при этом в растворе, сопровождаются образованием более стабильных форм кислорода. Так для реакции с участием хиноновой группировки флавоноида происходит перенос электрона с супероксид аниона на антиоксидант:

O₂^– + A = O₂ + A^{– •},

где А –хиноновая группировка флавоноида, а A^{– •} - семихинонная форма хиноновой группировки.

(O₂^– - ē = O₂ ; E^○_{pH 7} = 560 мВ)

Реакции с участием аскорбиновой кислоты, α-токоферола как и ДГК так же может протекать через стадию элиминирования с образованием пероксида водорода:

O₂^– + AH + H₂O = H₂O₂ + A^{– • (•)} + OH^-,

где AH / A^{– •(•)} – восстановленная / окисленная форма антиоксиданта

(O₂^– + H₂O + ē = HO₂^– +OH^– ; E^○_щел = 408 мВ, E^○_{pH 7} = 822 мВ)

Окислительно-восстановительные потенциалы антиоксидантов приведены в таблица 4.

Тем не менее, реакция будет протекать, если будет выполняться следующее соотношение:

ln(Keq) = ln((A^{– •})(O₂(H₂O₂))/(A(AH))(O₂^– )) > 0;

В данном выражении, при прочих равных условиях, для исследуемых антиоксидантов соотношением (O₂(H₂O₂))/(O₂^–) можно пренебречь. Соотношение же (A^–•)/(A(AH)) сильно зависит от растворимости исходных антиоксидантов в водной фазе - чем она ниже, тем ниже и ΔG, при условии (A^–•) << (A(AH)). Следовательно, величина ΔG (энергия Гиббса) при одинаковых условиях генерации АФК будет зависеть от концентрации антиоксиданта в водной фазе (A(AH)), которая, в свою очередь, зависит от константы распределения антиоксиданта между водной и липидной фазой, а так же от скорости диффузии из одной фазы в другую.

Низкая растворимость ДГК приводит к тому, что действующая концентрация антиоксиданта, находящаяся в водной фазе, значительно ниже, чем добавляемая в систему. Тем не менее, благодаря этим свойствам, данные соединения должны обладать высокой защитной способностью от перекисного окисления липидов, обрывая ветвление свободно радикальной цепи.

Сравнение потенциала окислительно-восстановительной реакции (термодинамическая составляющая), в которой участвует ДГК и растворимость в водной фазе (кинетическая составляющая) показало, что при исследовании АОА и АРА необходимо учитывать оба эти параметра. Низкий потенциал полуреакции восстановления хиноновой группировки до семихиноновой формы указывает на возможность обратной реакции, что проявляется, в ряде случаев, в виде наличия прооксидантных свойств.

Как видно из таблицы 4, ДГК обладает высокой антирадикальной активностью в биохимической модельной системе, и по своим свойствам сравним с аскорбиновой кислотой.

Таблица 4. Антиоксидантные свойства дигидрокверцетина в “биохимической” и “клеточной” системах. С_АРА – концентрация, соответствующая антирадикальной активности соединения; С_АОА – концентрация, соответствующая антиокислительной активности соединения; БХС – биохимическая модельная система (пероксидаза хрена – люминол – H ₂ O ₂ ); ФС – фагоцитсодержащая модельная система (лейкоциты крови здорового животного – люминол - ФМА).