Определение лекарственной чувствительности микобактерий

Определение спектра и степени чувствительности микобактерий к противотуберкулёзным препаратам имеет важное клиническое значение, а также для эпидемиологической оценки распространения туберкулёза с лекарственной устойчивостью.

Кратность и сроки определения лекарственной чувствительности:

• до начала лечения однократно для определения стратегии и тактики лечения;

• при изоляции от больного культур из различного материала (мокрота, БАЛ, моча, экссудаты, ликвор и др.) исследуются все выделенные штаммы;

• в конце интенсивной фазы лечения при отсутствии клинико-рентгенологической динамики;

• при необходимости изменения схемы лечения в случае:

ü отсутствия негативации мокроты;

ü повторного выделения культуры после негативации мокроты;

ü резкого увеличения количества КУМ в мазке после первоначального снижения.

Определение лекарственной чувствительности микобактерий в настоящее время проводят микробиологическими методами:

• абсолютных концентраций (метод разведений на плотной или жидкой питательных средах),

• пропорций,

• коэффициента резистентности.

Обычно устойчивость проявляется в виде визуально наблюдаемого роста колоний микобактерий туберкулёза, однако существуют методики, индуцирующие рост в ранних стадиях деления клеток микобактерий в виде цветных реакций. Эти методы сокращают время проведения теста с 3-4 до 2 нед.

В качестве унифицированного в России получил распространение рекомендованный Комитетом по химиотерапии ВОЗ метод абсолютных концентраций, который с методической точки зрения является самым простым, однако требует высокой стандартизации и точности выполнения лабораторных процедур. Тест на лекарственную чувствительность состоит из набора пробирок с питательной средой, модифицированной противотуберкулёзными препаратами. Набор состоит из 2-3 пробирок с разными концентрациями каждого из используемых препаратов, одной контрольной пробирки со средой без препарата и одной пробирки, содержащей 1000 мкг/мл салициловокислого натрия или 500 мкг/мл паранитробензойной кислоты для выявления роста нетуберкулёзных микобактерий.

Для приготовления набора сред с препаратами используют модифицированную среду Левенштейна-Йенсена (без крахмала), которую разливают в колбы. В каждую из колб добавляют определённый объём соответствующего разведения противотуберкулёзного препарата. Содержимое колб тщательно перемешивают, разливают в пробирки и свёртывают в наклонном положении в течение 40 мин при температуре 85 °С. Свёртывание среды рекомендуют производить в электросвёртывателе с автоматической регулировкой температуры. Среда с противотуберкулёзными препаратами 1-го ряда может храниться в холодильнике при 2-4 °С в течение 1 мес, с препаратами 2-го ряда — не более 2 нед. Хранение сред с препаратами при комнатной температуре недопустимо. При приготовлении растворов противотуберкулёзных препаратов учитывают их активность, рассчитывая концентрацию с поправкой на молекулярную массу неспецифической части препарата, чистоту и т.д. Для определения лекарственной чувствительности используют только химически чистые субстанции.

Принцип метода состоит в определении концентрации противотуберкулёзного препарата, подавляющей рост значительной части популяции микобактерий. При правильном выполнении этот метод имеет хорошую достоверность.

Перед постановкой теста необходимо убедиться, что выделенная культура микобактерий туберкулёза не имеет посторонней микрофлоры. Из культуры микобактерий в 0,9% растворе натрия хлорида готовят гомогенную взвесь, содержащую 500 млн микробных тел в 1 мл (оптический стандарт мутности 5 единиц). Полученную взвесь разводят 0,9% раствором натрия хлорида (1:10) и вносят по 0,2 мл взвеси в каждую пробирку набора питательных сред. Засеянные пробирки помещают в термостат при 37 °С и выдерживают в горизонтальном положении в течение 2-3 сут, чтобы скошенная поверхность питательной среды была равномерно инокулирована взвесью микобактерий туберкулёза. Затем пробирки переводят в вертикальное положение и инкубируют в течение 3-4 нед. Учёт результатов проводят через 3-4 нед.

Поскольку сроки выделения возбудителя из клинического материала на питательных средах составляют не менее 1-1,5 мес, результаты определения лекарственной чувствительности указанным методом можно получить не ранее чем через 2-2,5 мес после посева материала. В этом заключается один из основных недостатков метода.

Интерпретируют результаты определения лекарственной чувствительности микобактерий на основе определённых критериев. На плотных средах культура считается чувствительной к той концентрации препарата, которая содержится в среде, если число колоний микобактерий, выросших на данной пробирке с препаратом, не превышает 20 при обильном росте на контрольной пробирке без препаратов. Только при наличии более 20 колоний культура расценивается как устойчивая к данной концентрации. На практике при получении результатов роста в опытных пробирках, близких к 20 КОЕ, необходимо известить клиническое подразделение, что чувствительность или устойчивость в этом случае носит пограничный характер, так как иногда это может объяснить нечёткую динамику клинических показателей.

Для различных препаратов установлена определённая концентрация, при которой наблюдают размножение критической доли микобактериальной популяции (табл. 2). Эти концентрации носят название «критические». В качестве критерия устойчивости используют величину роста популяции микобактерий на питательной среде с препаратом в критической концентрации.

Таблица 2